Mauruuru koe mo te toro ki Nature.com.Ko te putanga o te pūtirotiro e whakamahia ana e koe he iti te tautoko CSS.Mo nga hua pai, ka tūtohu kia whakamahia e koe he putanga hou ake o to kaitirotiro (whakawetohia ranei te Aratau Hototahi ki Internet Explorer).I tenei wa, ki te whakarite i te tautoko tonu, kei te whakaatu matou i te papanga me te kore taana, JavaScript ranei.
Ko te kitenga me te whakamahi whaihua o nga hua maori ka taea te whakapai ake i te oranga o te tangata.Ko nga matū aukati i te tipu o te tipu ka whakamahia nuitia hei patu otaota hei whakahaere i nga taru.Na te hiahia ki te whakamahi i nga momo momo patupatupatu, me tautuhi i nga puhui me nga tikanga mahi hou.I roto i tenei rangahau, i kitea e matou he pūhui N -alkoxypyrrole pūrākau, coumamonamide, mai i Streptomyces werraensis MK493-CF1 me te whakarite i te tukanga whakahiatotanga katoa.Na roto i nga whakamatautau mahi koiora, i kitea e matou ko te waikawa urs-monoamic he takawaenga waihanga o te urs-monoamide me te kaha.te aukati tipu tipu.I tua atu, kua whakawhanakehia e matou etahi momo momo waikawa urbenonic, tae atu ki te urbenyloxy derivative (UDA), he nui te mahi herbicidal me te kore e pa ki te tipu o nga pūtau HeLa.I kitea ano e matou ko nga hua o te waikawa urmotonic e whakararu ana i nga microtubules tipu;i tua atu, ka pa te KAND ki nga kakawaea actin me te whakaawe i te mate o te pūtau;He rereke enei paanga maha ki era o nga aukati microtubule e mohiotia ana me te whakaaro he tikanga hou mo te waikawa ursonic, e tohu ana i tetahi painga nui mo te whanaketanga o nga otaota hou.
Ko te kitenga me te whakamahi mahi o nga hua taiao whai hua me o raatau hua he huarahi hei whakapai ake i te oranga o te tangata.Ko nga metabolites tuarua i mahia e nga microorganisms, nga tipu me nga pepeke kua ahu whakamua ki te rongoa me te ahuwhenua.He maha nga rongoa paturopi me nga raau taero anti-reukemia kua hangaia mai i nga hua taiao.I tua atu, he momo momopesticides, ka tangohia mai i enei hua maori hei whakamahi i nga mahi ahuwhenua.Otirā, he taputapu nui te patu patu tarutaru hei whakanui ake i nga hua o nga hua i roto i nga mahi ahuwhenua o naianei, a kua whakamahia kee nga momo momo puhui ki te hokohoko.He maha nga tukanga pūtau i roto i nga tipu, penei i te photosynthesis, te waikawa amino metabolism, te whakahiato i te pakitara o te pakitara, te whakarite i te mitosis, te tohu phytohormone, te whakahiato pūmua ranei, e kiia ana he whainga angamaheni o te patupatupatu.Ko nga puhui e aukati ana i te mahi microtubule he momo patupatupatu ka pa ki te tipu o te tipu ma te pa ki nga ture mitotic2.
Ko nga microtubules he waahanga o te cytoskeleton, he nui te tiaki i roto i nga pūtau eukaryotic.Ko te heterodimer tubulin ko te α-tubulin me te β-tubulin e hanga ana i nga protofilaments microtubule linear, me te 13 protofilaments e hanga ana i te hanganga porotakaroa.He maha nga mahi a nga microtubules i roto i nga tipu tipu, tae atu ki te whakatau i te ahua o te pūtau, te wehenga pūtau, me te kawe i roto i te pūtau3,4.Kei roto i nga ruma tipu nga microtubules i raro i te membrane plasma interphase, a ko enei e kiia nei ko nga microtubules cortical e whakaarohia ana hei whakahaere i te whakahaere o nga microfibrils cellulose na roto i te ture o te cellulose synthase complexes4,5.Ko nga microtubules cortical o nga pūtau epidermal pakiaka, kei roto i te rohe o te tere elongation o te matamata pakiaka, kei te taha taha, me te microfibers cellulose whai i enei microtubules me te whakawhāiti i te ahunga o te roha pūtau, reira whakatairanga i te elongation pūtau anisotropic.Na reira, ko te mahi microtubule he hononga tata ki te ahua o te tipu.Ko te whakakapi i te waikawa amino i roto i nga ira e whakawaehere ana i te tubulin ka paopao nga huinga microtubule cortical me te tipu taha maui-matau ranei i roto i te Arabidopsis 6,7.Waihoki, ko nga huringa i roto i nga pūmua e hono ana ki te microtubule e whakahaere ana i te hihiri o te microtubule ka taea hoki te arahi ki te tipu o te pakiaka kua he8,9,10,11,12,13.I tua atu, ko te maimoatanga ki te microtubule-disrupting herbicides penei i te disopyramide, e mohiotia ana ko te pretilachlor, ka tupu ano te tipu o te taha maui14.Ko enei raraunga e tohu ana he mea nui te whakarite tika mo te mahi microtubule mo te whakatau i te ahunga o te tipu tipu.
He maha nga momo aukati microtubule kua kitea, a ko enei raau taero i whai waahi nui ki te rangahau cytoskeletal, tae atu ki nga mahi ahuwhenua me te rongoa2.Ina koa, ko te oryzalin, te dinitroaniline pūhui, te disopyramide, te pūhui e pā ana ki te benzamide, me o ratou tairitenga ka taea te aukati i te mahi microtubule me te aukati i te tipu o te tipu.No reira, ka whakamahia nuitia hei patu patupatu.Heoi, i te mea ko nga microtubule he waahanga nui o nga tipu me nga pūtau kararehe, ko te nuinga o nga aukati microtubule he cytotoxic ki nga momo pūtau e rua.No reira, ahakoa to ratou whaipainga hei patu patupatu, he iti noa te maha o nga matū antimicrotubule e whakamahia ana mo nga kaupapa mahi.
Ko Streptomyces he puninga no te whanau Streptomyces, kei roto ko nga huakita aerobic, karamu pai, kawa me te rongonui mo tona kaha ki te whakaputa i nga momo metabolites tuarua.Na reira, e kiia ana ko tetahi o nga tino puna nui o nga hua hou o te taiao koiora.I roto i te rangahau o naianei, i kitea e matou he puhui hou e kiia nei ko coumamonamide, i wehea mai i Streptomyces werraensis MK493-CF1 me S. werraensis ISP 5486. Ma te whakamahi i te tātaritanga maataki me te tātaritanga maataki katoa, i tohuhia te hanganga o te coumamonamide me tona anga motuhake N-alkoxypyrrole. i whakaritea.whakahiato.Ko te waikawa Ursmonic, he takawaenga waihanga o te ursmonoamide me ona huanga, i kitea ki te aukati i te tipu me te germination o te tipu tauira rongonui Arabidopsis thaliana.I roto i te rangahau hononga hanganga-ngohe, i kitea e matou ko tetahi puhui me te C9 kua whakarereketia ki te waikawa ursonic, e kiia nei ko te nonyloxy derivative o te waikawa ursonic (KAND), ka tino whakanui ake i te awenga aukati i te tipu me te whakatipu.Otirā, ko te aukati tupu tipu hou i kitea i pa ki te tipu o te tupeka me te tautuku ate, a, ehara i te cytotoxic ki nga huakita me nga pūtau HeLa.I tua atu, ko etahi pärönaki waikawa urmotonic e whakakorikori ana i te ahua o te pakiaka, e kii ana ko enei pärönaki ka pa ki nga microtubules.E rite ana ki tenei whakaaro, ko o maatau kitenga mo nga microtubules kua tapaina ki te immunohistochemically, ki nga pūmua fluorescent ranei e tohu ana ka whakakorehia e te maimoatanga KAND nga microtubules.I tua atu, ko te maimoatanga me nga hua o te waikawa kumamotonic i pakaru nga microfilaments actin.No reira, kua kitea e matou he aukati tipu tipu hou ko tana mahi ahurei ko te whakangaro i te cytoskeleton.
Ko te riaka MK493-CF1 i wehea mai i te oneone i Shinagawa-ku, Tokyo.Ko te riaka MK493-CF1 i hanga mai i te stromal mycelium.Ko te raupapa wahanga o te ira RNA ribosomal 16S (1422 bp) i whakatauhia.He tino rite tenei riaka ki te S. werraensis (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: riaka angamaheni, 99.93%).I runga i tenei hua, i whakatauhia he hononga tata tenei riaka ki te momo riaka o S. werraensis.No reira, i whakaingoatia e matou tenei riaka S. werraensis MK493-CF1.Ko te S. werraensis ISP 5486T ka whakaputa ano i nga puhui koiora.I te mea he iti noa nga rangahau moata ki te tiki hua mai i tenei moroiti, i mahia ano he rangahau matū.I muri i te maara o te S. werraensis MK493-CF1 i runga i te reo parei na roto i te fermentation solid-state i te 30°C mo nga ra 14, ka tangohia te reo me te 50% EtOH.60 ml o te tauira i whakamaroke kia 59.5 mg o te tangohanga masivesivá.Ko te tangohanga masivesivá i tukuna ki te wahanga whakamuri HPLC ki te hoatu N-methoxy-1H-pyrrole-2-carboxamide (1, ingoa coumamonamide, 36.0 mg).Ko te tapeke o te 1 he 60% o te tangohanga masivesivá.Na reira, i whakatau matou ki te ako i nga ahuatanga o te kumamotoamide 1.
Ko te Coumamonamide 1 he paura amorphous ma me te taumira teitei teitei spectrometry papatipu (HRESIMS) whakau C6H8N2O2 (Fig. 1).Ko te kongakonga pyrrole kua whakakapihia e C2 o tenei puhui e tohuhia ana e δH 6.94 (1H, t, J = 2.8, 4.8 Hz, H-4), δH 6.78 (1H, d, J = 2.5, δH i roto i te 1H NMR spectrum: 4.5 Hz , H-5) me te δH 6.78 (1H, d, J = 2.5 Hz, H-6), me te 13C NMR spectrum e whakaatu ana i te aroaro o nga ngota waro sp2 e wha.Ko te noho o te roopu amide i te waahi C2 i aromatawaihia e te HMBC correlation mai i te C-3 proton ki te waro waro amide i te δC 161.1.I tua atu, ko te 1 H me te 13 C NMR nga tihi i te δH 4.10 (3H, S) me te δC 68.3 e tohu ana i te noho o nga roopu N-methoxy i roto i te ngota.Ahakoa kaore ano kia whakatauhia te tuunga tika o te roopu methoxy ma te whakamahi i te tātaritanga spectroscopic penei i te whakahiatotanga rereke rereke me te whakapotonga karihi Overhauser (NOEDF), ka noho ko N-methoxy-1H-pyrrole-2-carboxamide te huinga kaitono tuatahi.
Hei whakatau i te hanganga tika o te 1, i mahia he kohinga katoa (Fig. 2a).Ko te maimoatanga o te 2-aminopyridine 2 e waatea ana ki te hokohoko me te m-CPBA ka puta ko te N-oxide 3 e rite ana ki te hua ine.I muri i te 2-aminoazidation o 2, ko te tauhohenga cyclocondensation i whakaahuatia e Abramovich i mahia i roto i te benzene i te 90°C kia whiwhi ai i te 1-hydroxy-1H-pyrrole-2-carbonitrile 5 e hiahiatia ana i roto i te karamu.Tere 60% (e rua nga wahanga).15,16.Ko te methylation me te hauwai o te 4 ka hoatu he waikawa 1-methoxy-1H-pyrrole-2-carboxylic (e kiia ana ko te "waikawa cumotonic", 6) he pai te hua (70%, e rua nga kaupae).Ka mutu, ko te whakakorikori ma te waikawa pūhaumāota takawaenga 6 mā te haukini wai i hoatu te amide Kumamoto 1 i roto i te 98% hua.Ko nga raraunga matakite katoa o te 1 kua whakahiatohia he rite ki te 1 motuhake, na reira i whakatauhia te hanganga o te 1;
Te whakahiato me te tātaritanga o te mahi koiora o te urbenamide me te waikawa urbenic.(a) Te whakahiatotanga katoa o te amide Kumamoto.(b) E whitu nga ra te pakeke o te momo mohoao Arabidopsis Columbia (Col) tipu i tipu ki runga i nga papaa Murashige me Skoog (MS) kei roto te coumamonamide 6 me te coumamonamide 1 i nga kohinga kua tohua.Pae tauine = 1 cm.
Tuatahi, i aromatawaihia e matou nga mahi koiora o te urbenamide me ona takawaenga mo to raatau kaha ki te whakarereke i te tipu tipu.I taapirihia e matou etahi momo kukū o te ursmonamide 1, te waikawa ursmonic 6 ranei ki te reo MS agar me nga tipu araidopsis thaliana kua whakatipuria ki runga i tenei tikanga.Ko enei whakamatautau i whakaatu ko nga kohinga teitei (500 μM) o te 6 i aukati i te tipu pakiaka (Fig. 2b).I muri mai, i hangaia e matou etahi momo pärönaki ma te whakakapi i te tuunga N1 o te 6 me te mahi rangahau hononga hanganga-mahi ki runga i a raatau (ko te tikanga whakahiato tairitenga e whakaahuatia ana i roto i nga korero tautoko (SI)).I tipuhia nga tipu Arabidopsis ki runga i te reo e 50 μM nga hua o te waikawa ursonic, ka ine te roa o te pakiaka.i whakaaturia i runga i te pikitia.E whakaatu ana i nga Whakaahua 3a, b, me S1, he rereke te roa o nga waikawa coumamo o nga mekameka alkoxy raina (9, 10, 11, 12, me 13) ranei nga mekameka alkoxy nui (15, 16, me 17) i te turanga N1.I whakaatuhia e nga pärönaki te tino aukati i te tipu o te pakiaka.I tua atu, i kitea e matou ko te whakamahinga o te 200 μM 10, 11, 17 ranei i aukati i te whakatipu (Fig. 3c me S2).
Te rangahau mo te hononga hanganga-mahi o te amide Kumamoto me nga puhui e pa ana.(a) Te hanganga me te kaupapa whakahiato o nga tairitenga.(b) Te inenga o te roa o te pakiaka o nga tipu 7-ra te pakeke i tupu i runga i te reo MS me te kore ranei o te 50 μM coumamonamide derivatives.Ko nga wheturangi e whakaatu ana i nga rereketanga nui me te maimoatanga horihori (whakamatautau t, wh<0.05).n>18. Ko nga raraunga e whakaatuhia ana ko te toharite ± SD.Ko te tikanga o te nt "kaore i whakamatauria" no te mea neke atu i te 50% o nga kakano kaore i tipu.(c) Te ine i te tere germination o nga kakano i rongoatia mo nga ra e 7 i roto i te reo MS me te kore 200 μM coumamonamide me nga puhui e pa ana.Ka tohu nga whetūriki i nga rereketanga nui ki te maimoatanga tinihanga (whakamatautau chi-square).n=96.
Ko te mea whakamiharo, ko te taapiri o nga mekameka taha alkyl he roa ake i te C9 i whakaitihia te mahi aukati, e kii ana ko nga pūhui waikawa kumamotoic e hiahia ana ki nga mekameka taha o tetahi rahi hei whakaatu i o raatau mahi koiora.
Na te mea i whakaatuhia e te tātaritanga hononga hanganga-mahinga i whakarereketia te C9 ki te waikawa ursonic me te pärönaki nonyloxy o te waikawa ursonic (i muri nei ka kiia ko KAND 11) te tino aukati i te tipu o te tipu, i whakahaerehia e matou he tohu mo te KAND 11. Te maimoatanga o Arabidopsis ki te 50 μM KAND 11 tata tino ārai germination, engari nohanga iti (40, 30, 20, ranei 10 μM) o KAND 11 tautāwhi i te tupu pakiaka i roto i te tikanga horopeta-ti'aturi (Fig. 4a, b).Hei whakamatautau mena ka pa te KAND 11 ki te oranga o te meristem pakiaka, i tirohia e matou nga meristem pakiaka kua poke ki te propidium iodide (PI) me te ine i te rahi o te rohe meristem.Ko te rahi o te meristem o nga tipu tipu i runga i te reo kei roto 25 μM KAND-11 ko 151.1 ± 32.5 μm, ko te rahi o te meristem o nga tipu tipu i runga i te reo whakahaere kei roto DMSO ko 264.7 ± 30.8 μm (Fig. 4c, d). , e tohu ana ko te KAND-11 te whakaora i nga mahi a te waea.horahanga.Meristem pakiaka.I runga i tenei, ka whakaitihia e te maimoatanga KAND 11 te nui o te tohu wehewehenga pūtau CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS tohu i roto i te meristem pakiaka (Fig. 4e) 17 .Ko enei hua e tohu ana ko te KAND 11 te aukati i te tipu o te pakiaka ma te whakaiti i te mahi whakatipu pūtau.
Te tātaritanga o te awenga aukati o te waikawa urbenonic derivatives (urbenyloxy derivatives) ki te tipu.(a) Ko nga tipu Col mohoao e 7-ra te pakeke i tipu ki runga i nga papaa MS me te tohu o te KAND 11. Pae tauine = 1 cm.(b) Te ine i te roa o te pakiaka.Ko nga reta e whakaatu ana i nga rereketanga nui (whakamatautau Tukey HSD, wh<0.05).n>16. Ko nga raraunga e whakaatuhia ana ko te toharite ± SD.(c) Kaitito whakaata o te propidium iodide kua pokea nga pakiaka Col mohoao i tupu ki nga papa MS me te 25 μM KAND kore ranei.Pae tauine = 100 µm.(d) Te ine i te rahi meristem pakiaka (n = 10 ki te 11).I whakatauhia nga rereketanga tatauranga ma te whakamahi i te whakamatautau-t (wh<0.05).Ko nga tutaki e tohu ana i te rahi meristem toharite.(e) Mauritaki rereke pokanoa (DIC) o te meristem pakiaka kei roto te hanga CDKB2;1pro: CDKB2;1-GUS kua pania, kua pokea ki nga tipu e 5-ra te pakeke i tupu ki runga i nga papaa MS me te 25 µM KAND whakamatautau me te kore ranei.
I whakamatauria ano te phytotoxicity o KAND 11 ma te whakamahi i tetahi atu tipu dicotyledonous, tupeka (Nicotiana tabacum), me tetahi rauropi tauira tipu whenua nui, liverwort (Marchantia polymorpha).Pērā i te take o Arabidopsis, ko nga tipu tupeka SR-1 i tupu i runga i te reo kei roto 25 μM KAND 11 he poto ake nga pakiaka (Fig. 5a).I tua atu, 40 o te 48 nga kakano i tipu ki runga i nga pereti kei roto te 200 μM KAND 11, engari ko nga kakano 48 katoa i tipu ki runga i nga papaaho whakahiahia, e tohu ana he nui te nui o nga kuhanga o te KAND (p<0.05;chi test -square) i aukati i te tipu o te tupeka.(Whakaahua 5b).I tua atu, ko te kukū o te KAND 11 i aukati i te tipu huakita i roto i te liverwort he rite ki te kukū whai hua i roto i te Arabidopsis (Fig. 5c).Ko enei hua ka tohu ka taea e KAND 11 te aukati i te tipu o nga momo tipu.Na ka tirotirohia e matou te paheketanga pea o nga puhui e pa ana ki te pea monoamide i roto i etahi atu rauropi, ara nga pūtau HeLa tangata me te Escherichia coli riaka DH5α, hei kanohi mo nga pūtau kararehe teitei ake me te huakita.I roto i te raupapa o nga whakamatautau mo te tipu o te pūtau, i kitea e matou ko te coumamonamide 1, te waikawa coumamonamidic 6, me te KAND 11 kaore i pa ki te tipu o te HeLa, E. coli ranei i nga kohinga o te 100 μM (Fig. 5d, e).
Te aukati i te tipu o te KAND 11 i roto i nga rauropi kore-Arabidopsis.(a) E rua wiki te pakeke o nga tipu tupeka momo mohoao SR-1 i whakatipuhia ki runga i nga papaa MS kua tuu poutū, kei roto te 25 μM KAND 11. (b) I whakatipuria nga tipu tupeka momo mohoao SR-1 e rua wiki ki runga i te tuunga whakapae. Pereti MS kei roto 200 μM KAND 11. ( c) E rua wiki te pakeke o nga puku mohoao Tak-1 i tupu ki runga i nga pereti Gamborg B5 me nga tohu kua tohua o KAND 11. Ko nga pere whero e tohu ana i nga pua kua mutu te tipu i roto i nga wiki e rua. wā.(d) Te whakamatautau whakahiato o nga pūtau o nga pūtau HeLa.I inehia te maha o nga pūtau whaihua i nga wa kua whakaritea ma te whakamahi i te kete tatau 8 (Dojindo).Hei mana whakahaere, i tukuna nga pūtau HeLa ki te 5 μg/ml actinomycin D (Act D), e aukati ana i te RNA polymerase transcription me te mate pūtau.I mahia nga tātaritanga i roto i te taarua.(e) E. coli cell proliferation test.I tātarihia te tipu o te E. coli ma te ine i te OD600.Hei mana whakahaere, ka tukinotia nga pūtau ki te 50 μg/ml ampicillin (Amp), e aukati ana i te whakahiatotanga o te pakitara kirikita.I mahia nga tātaritanga i roto i te taarua.
Hei whakamaarama i te tikanga o te mahi o te cytotoxicity i puta mai i nga puhui e pa ana ki te uramide, i tātarihia ano e matou nga hua o te waikawa urbenic me nga paanga aukati ngawari.i whakaaturia i runga i te pikitia.E whakaatu ana i nga Whakaahua 2b, 6a, ko nga tipu i tupu i runga i nga papaa agar e mau ana te nui o te kukū (200 μM) o te waikawa urmotonic 6 i hua poto ake me te kopiko maui nga pakiaka (θ = - 23.7 ± 6.1), engari o nga tipu i tupu i runga i te tikanga whakahaere, ko te tata tika tonu te puta o nga wana (θ = – 3.8 ± 7.1).Ko tenei ahuatanga o te tipu titaha e mohiotia ana na te ngoikoretanga o nga microtubules cortical14,18.E rite ana ki tenei kitenga, na nga raau taero-whakararuraru-microtubule te disopyramide me te oryzalin i whakapakeke i te ahua o nga pakiaka i raro i o maatau tipu (Fig. 2b, 6a).I taua wa ano, i whakamatauria e matou nga hua o te waikawa urmotonic me te whiriwhiri i etahi o era, i etahi wa, i whakaawehia te tipu o te pakiaka.Ko nga huinga 8, 9, me te 15 i whakarereke i te ahunga o te tipu pakiaka i te 75 μM, 50 μM, me te 40 μM, e tohu ana ka taea e enei pūhui te whakakore i nga microtubules (Fig. 2b, 6a).I whakamatauria ano e matou te kaha o te waikawa ursolic acid, KAND 11, i te iti o te kukū (15 µM) ka kitea ko te tono KAND 11 ka aukati i te tipu o te pakiaka me te koretake o te ahunga o te tipu o te pakiaka, ahakoa ka heke ki te taha maui ( Whakaatu C3)..I te mea ko te nui ake o nga raau taero whakararu i te microtubule i etahi wa ka aukati i te tipu o te tipu, kaua ki te whakatitaha i te pakiaka, ka arotakehia e matou te tupono ka pa te KAND 11 ki nga microtubules ma te mataki i nga microtubules cortical i roto i nga pūtau epidermal pakiaka.Immunohistochemistry ma te whakamahi i nga anti-β-tubulin antibody i roto i nga pūtau epidermal o nga pakiaka huero e tukinotia ana ki te 25 μM KAND 11 i whakaatu i te ngaro o te tata katoa o nga microtubules cortical i roto i nga pūtau epidermal i te rohe elongation (Fig. 6b).Ko enei hua e tohu ana ko te waikawa kumamotonic me ona huanga ka mahi tika, arai ranei ki runga microtubules hei whakararu i a raatau, a ko enei puhui he aukati microtubule hou.
Ko te waikawa Ursonic me ona huanga ka whakarereke i nga microtubules cortical i Arabidopsis thaliana.(a) Ko te koki toronga o te pakiaka ka ine ki te aroaro o nga momo pärönaki waikawa urmotonic i ngä kuhanga kua tohua.Ko nga paanga o nga puhui e rua e mohiotia ana hei aukati i nga microtubules: disopyramide me te oryzalin i tātarihia ano.Ko te whakaurunga e whakaatu ana i te paerewa e whakamahia ana hei ine i te koki tipu o te pakiaka.Ko nga wheturangi e whakaatu ana i nga rereketanga nui me te maimoatanga horihori (whakamatautau t, wh<0.05).n>19. Pae tauine = 1 cm.(b) Nga microtubules cortical i roto i nga pūtau epidermal i te rohe whakaroa.Microtubules i roto i te momo mohoao Arabidopsis Col pakiaka tupu i runga i nga papa MS me te kore ranei o te 25 μM KAND 11 i kitehia e te taatai immunohistochemical ma te whakamahi i nga paturopi tuatahi o te β-tubulin me te Alexa Fluor-conjugated antibodies tuarua.Pae tauine = 10 µm.(c) Te anga mitotic o te microtubules i te meristem pakiaka.Ko nga microtubules i whakaatahia ma te whakamahi i te taera immunohistochemical.Ko nga hanganga mitotic, tae atu ki nga rohe prophase, spindles, me te phragmoplasts, i tatauhia mai i nga whakaahua confocal.Ko nga pere e tohu ana i nga hanganga microtubule mitotic.Ko nga wheturangi e whakaatu ana i nga rereketanga nui me te maimoatanga horihori (whakamatautau t, wh<0.05).n>9. Pae tauine = 50 µm.
Ahakoa kei a Ursa te kaha ki te whakararu i te mahi microtubule, ko te tikanga he rereke te tikanga o tana mahi mai i nga apiha depolymerizing microtubule.Hei tauira, ko te nui ake o nga kuhanga o nga microtubule depolymerizing agents penei i te disopyramide me te oryzalin ka whakaawe i te roha anisotropic o nga pūtau epidermal, engari ko te KAND 11 kaore.I tua atu, ko te tono-tahi o te KAND 11 me te disopyramide i hua mai i te urupare o te tipu o te pakiaka o te disopyramide me te aukati i te tipu o te KAND 11 i kitea (Fig. S4).I wetewetehia ano e matou te urupare a te disopyramide hypersensitive 1-1 (phs1-1) mutant ki te KAND 11. Ko te phs1-1 he rerekee ira tubulin kinase kore-kanoni me te whakaputa i nga pakiaka poto ake ina rongoatia ki te disopyramide9,20.Ko nga tipu mutant phs1-1 i tupu i runga i te reo agar me te KAND 11 he poto ake nga pakiaka rite ki era i tupu ki runga disopyramid (whakaahua S5).
I tua atu, i kite matou i nga hanganga microtubule mitotic, penei i nga rohe prophase, spindles, me te phragmoplasts, i roto i te meristem pakiaka o nga tipu kua tukinotia ki te KAND 11. E rite ana ki nga tirohanga mo CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS, he tino hekenga i kitea te maha o nga microtubules mitotic (Fig. 6c).
Hei tohu i te cytotoxicity o KAND 11 i te taumira subcellular, i rongoatia e matou te tupeka BY-2 pūtau whakatārewatanga me te KAND 11 me te kite i ta raatau whakautu.I te tuatahi ka taapirihia e matou te KAND 11 ki nga pūtau BY-2 e whakaatu ana i te TagRFP-TUA6, e tapanga ana i nga microtubules, hei aromatawai i te paanga o te KAND 11 ki nga microtubules cortical.I aromatawaihia te kiato microtubule cortical ma te whakamahi i te tātari atahanga, i tohuhia te paheketanga o nga pika cytoskeletal i waenga i nga pika cytoplasmic.Ko nga hua whakamatautau i whakaatu i muri i te maimoatanga me te 50 μM ranei 100 μM KAND 11 mo te 1 haora, ka tino heke te kiato ki te 0.94 ± 0.74% ranei 0.23 ± 0.28%, ia, i te mea ko te kiato o nga pūtau i tukinotia ki te DMSO, he 1.61 ± 0.34. % (Whakaahua 7a).Ko enei hua e rite ana ki te tirohanga i roto i te Arabidopsis ko te maimoatanga KAND 11 e akiaki ana i te depolymerization o nga microtubules cortical (Fig. 6b).I tirotirohia ano e matou te raina BY-2 me nga kakawaea actin kua tapaina ki te GFP-ABD i muri i te maimoatanga me te rite o te kukū o te KAND 11 me te kite ko te maimoatanga KAND 11 i pakaru nga kakawaea actin.Ko te maimoatanga me te 50 μM ranei 100 μM KAND 11 mo te 1 h ka tino whakahekehia te kiato filament actin ki te 1.20 ± 0.62% ranei 0.61 ± 0.26%, i te mea ko te kiato i roto i nga ruma kua tukinotia e DMSO ko 1.69 ± 0.51% (Fig.7b).He rereke enei hua ki nga paanga o te propyzamide, kaore e pa ki nga filaments actin, me te latrunculin B, he depolymerizer actin kaore e pa ki nga microtubules (SI Figure S6).I tua atu, ko te maimoatanga me te coumamonamide 1, te waikawa coumamonamide 6, te KAND 11 ranei kaore i pa ki nga microtubules i roto i nga kamera HeLa (SI Figure S7).No reira, ko te tikanga o te mahi a KAND 11 e whakaponohia ana he rereke mai i tera o nga kai whakakino cytoskeleton e mohiotia ana.I tua atu, ko ta maatau tirohanga moroiti o nga pūtau BY-2 i tukinotia ki te KAND 11 i whakaatu i te timatanga o te mate o te pūtau i te wa o te maimoatanga KAND 11 me te whakaatu ko te waahanga o nga pūtau mate puru-puru Evans kaore i tino piki ake i muri i te 30 min o te maimoatanga KAND 11, engari i muri i nga meneti 90 o te maimoatanga me te 50 μM ranei 100 μM KAND, ka piki ake te maha o nga pūtau mate ki te 43.7% ranei 80.1%, ia (Fig. 7c).Ka huihuia, ko enei raraunga e tohu ana ko te KAND 11 te whakaputanga waikawa ursolic hou he aukati cytoskeletal motuhake o te tipu me tetahi tikanga mahi kaore i mohiotia i mua.
Ka pa te KAND ki nga microtubules cortical, filaments actin, me te oranga o te tupeka BY-2 pūtau.(a) Te tirohanga o nga microtubules cortical i roto i nga ruma BY-2 i te aroaro o TagRFP-TUA6.Ko nga pūtau BY-2 i tukinotia ki te KAND 11 (50 μM, 100 μM) ranei, i tirotirohia e te mataiti mataiti.I tatauhia te kiato microtubule cortical mai i nga micrographs o 25 pūtau motuhake.Ko nga reta e whakaatu ana i nga rereketanga nui (whakamatautau Tukey HSD, wh<0.05).Pae tauine = 10 µm.(b) Ko nga kakawaea actin cortical i roto i nga pūtau BY-2 ka kitea i te aroaro o te GFP-ABD2.Ko nga pūtau BY-2 i tukinotia ki te KAND 11 (50 μM, 100 μM) ranei, i tirotirohia e te mataiti mataiti.Ko te kiato o nga kakawaua cortical actin i tatauhia mai i nga moroiti o te 25 nga pūtau motuhake.Ko nga reta e whakaatu ana i nga rereketanga nui (whakamatautau Tukey HSD, wh<0.05).Pae tauine = 10 µm.(c) Te mataki i nga pūtau BY-2 kua mate ma te tae kahurangi o Evans.Ko nga pūtau BY-2 i tukinotia ki te KAND 11 (50 μM, 100 μM) ranei i tirotirohia e te DMSO e te mataiti maramara.n=3.Pae tauine = 100 µm.
Ko te kitenga me te whakamahi i nga hua maori hou kua ahu whakamua ki nga momo ahuatanga o te oranga o te tangata, tae atu ki te rongoa me te ahuwhenua.Kua mahia nga rangahau o mua ki te tiki i nga puhui whai hua mai i nga rawa taiao.Ina koa, ko te actinomycetes e mohiotia ana he pai hei paturopi antiparasitic mo nga nematodes na to ratou kaha ki te whakaputa i nga momo metabolites tuarua penei i te avermectin, te puhui mata o te ivermectin me te bleomycin me ona hua, whakamahia hei rongoa hei kaihoko mate pukupuku21,22.Waihoki, he maha nga momo puhui otaota kua kitea mai i te actinomycetes, ko etahi o enei kua whakamahia ki te hokohoko1,23.Na reira, ko te tātaritanga o nga metabolites actinomycete ki te wehe i nga hua taiao me nga mahi koiora e hiahiatia ana ka whakaarohia he rautaki whai hua.I roto i tenei rangahau, i kitea e matou he puhui hou, ko te coumamonamide, mai i te S. werraensis me te whakahiato pai.Ko te waikawa Ursonic he takawaenga waihanga o te urbenamide me ona hua.Ka taea e ia te ahua o te koiri o te pakiaka, te whakaatu i te ahua ngawari ki te kaha o te mahi patu otaota, me te tukino tika, arai ranei i nga microtubule tipu.Heoi ano, he rereke pea te mahi a te waikawa urmotonic i tera o nga aukati microtubule o naianei, na te mea ka whakararu hoki a KAND 11 i nga kakawaea actin me te mate o nga pūtau, e kii ana he tikanga whakahaere e awe ai te waikawa urmotonic me ona huanga ki te whānuitanga o nga hanganga cytoskeletal..
Ma te whakamarama ake o nga ahuatanga o te waikawa urbenonic ka pai ake te maarama ki te tikanga o te mahi a te waikawa urbenonic.Ina koa, ko te whainga e whai ake nei ko te arotake i te kaha o te waikawa ursonic ki te here ki nga microtubules iti ki te whakatau mena ka mahi tika te waikawa ursonic me ona hua ki runga i nga microtubules me te whakakore i a raatau, mena ka puta mai ranei ta raatau mahi ki te microtubule destabilization.I tua atu, i roto i te take kaore nga microtubules i te whainga tika, ko te tautuhi i te waahi o te mahi me nga taumata ngota o te waikawa ursonic i runga i nga tipu tipu ka awhina i te mohio ake ki nga ahuatanga o nga pūhui e pa ana me nga huarahi hei whakapai ake i te mahi patupatu.I whakaatuhia e ta maatau whakamatautau koiora te kaha cytotoxic ahurei o te waikawa ursonic i runga i te tipu o nga tipu penei i te Arabidopsis thaliana, te tupeka me te liverwort, i te mea karekau nga pūtau E. coli me HeLa i pa.Ko te iti, te kore ranei o te paitini ki nga pūtau kararehe he painga o nga hua o te waikawa ursonic mena ka hangaia hei patupatupatu hei whakamahi i nga mara ahuwhenua tuwhera.Inaa, i te mea he hanga noa nga microtubules i roto i nga eukaryotes, ko ta ratou aukati i roto i nga tipu he whakaritenga matua mo nga patupatupatu.Hei tauira, ka whakamahia te propyzamide, he maatete whakaheke microtubule e hono tika ana ki te tubulin me te aukati i te polymerization, ka whakamahia hei patupatu na te iti o te paitini ki nga pūtau kararehe24.He rereke ki te disopyramide, he rereke nga ahuatanga o nga benzamides.I tua atu i nga microtubules tipu, ka whakakorehia e te RH-4032, te benzoxamide ranei nga microtubules o nga kamera kararehe, oomycetes ranei, ka whakamahia te zalilamide hei fungicide na te iti o te phytotoxicity25,26,27.Ko te pea katahi ano ka kitea me ona hua e whakaatu ana i te cytotoxicity ki runga i nga tipu, engari me mahara ka taea e etahi atu whakarereketanga te whakarereke i to raatau whaainga, tera pea ka whai hua ano hei whakahaere i nga harore pathogenic, oomycetes ranei.
Ko nga ahuatanga ahurei o te waikawa urbenonic me ona huanga ka whai hua mo te whakawhanaketanga hei patupatupatu me te whakamahi hei taputapu rangahau.Ko te hiranga o te cytoskeleton ki te whakahaere i te ahua o te tipu o te tipu e mohiotia ana.Ko nga rangahau o mua kua whakaatuhia kua tipuhia e nga tipu nga tikanga uaua o te whakahaere microtubule cortical ma te whakahaere i nga hihiri microtubule ki te whakahaere tika i te morphogenesis.He maha nga ngota ngota e whakahaere ana i nga mahi microtubule kua kitea, kei te haere tonu nga rangahau e pa ana3,4,28.Ko to maatau mohiotanga o naianei mo te hihiri o te microtubule i roto i nga tipu tipu kaore i te tino whakamarama i nga tikanga o te whakahaere microtubule cortical.Hei tauira, ahakoa ka taea e te disopyramide me te oryzalin te whakakore i nga microtubules, ka raru nga pakiaka o te disopyramide engari he ngawari te paanga o te oryzalin.I tua atu, ko nga huringa i roto i te tubulin, e whakapumau ana i nga microtubules, ka puta ano te dextrorotation i roto i nga pakiaka, engari ko te paclitaxel, e whakapumau ana i te hihiri microtubule, kaore.Na reira, ko te ako me te tautuhi i nga whaainga ngota o te waikawa ursolic me whai matauranga hou mo te whakaritenga o nga microtubules cortical tipu.Waihoki, ko nga whakataurite a muri ake o nga matū e whai hua ana ki te whakatairanga i te tipu kerekere, penei i te disopyramide, me nga matū iti ake te whai hua, penei i te oryzalin, te waikawa kumamotoric ranei, ka whakaatu i te ahua o te tipu kino.
I tetahi atu taha, ko nga whakarereketanga o te cytoskeletal e pa ana ki te parenga tetahi atu huarahi hei whakamarama i te cytotoxicity o te waikawa ursonic.Ko te mate o te tukumate, te whakauru mai ranei o te elicitor ki roto i nga tipu tipu i etahi wa ka mate te cytoskeleton me te mate o nga pūtau o muri29.Hei tauira, ko te cryptoxanthin i ahu mai i te oomycete kua panuitia ki te whakararuraru i nga microtubules me nga filaments actin i mua i te mate o te pūtau tupeka, he rite ki te mea ka puta ki te maimoatanga KAND30,31.Ko nga ritenga i waenga i nga whakautu parepare me nga urupare pūkoro i whakaawehia e te waikawa ursonic i arai matou ki te whakapae ka puta mai nga tikanga pūkoro noa, ahakoa he tere ake, he kaha ake te paanga o te waikawa ursonic i te cryptoxanthin.Heoi ano, kua kitea e nga rangahau ko te whakararu o nga kakawaea actin e whakatairanga ana i te mate ohooho noa, kaore i te haere tahi me te pakaruhanga microtubule29.I tua atu, ka kitea tonu mena na te tukumate, te elicitor ranei te take i paheke ai te tipu o te pakiaka, penei i nga hua o te waikawa ursonic.No reira, ko te matauranga irapoi e hono ana i nga urupare whakamarumaru me te cytoskeleton he raruraru ataahua hei whakatika.Ma te whakamahi i te aroaro o nga pūhui taumaha ngota iti e pa ana ki te waikawa ursonic, tae atu ki te whānuitanga o nga pärönaki he rereke te kaha, ka whai waahi pea ki te aro atu ki nga tikanga pūkoro e kore e mohiotia.
Ka huihuia, ko te kitenga me te tono o nga puhui hou e whakarereke ana i te hihiko microtubule ka whai tikanga kaha ki te whakatika i nga tikanga rapoi matatini kei raro i te whakatau i te ahua o te tipu.I roto i tenei horopaki, ka taea e te waikawa urmotonic puhui hou i whakawhanakehia, e pa ana ki nga microtubules me nga kakawaea actin me te whakapouri i te mate o te pūtau, ka whai waahi ki te whakamaarama i te hononga i waenga i te whakahaere microtubule me enei atu tikanga.No reira, ko te tātari matū me te koiora e whakamahi ana i te waikawa urbenonic ka awhina i a tatou ki te mohio ki nga tikanga whakahaere irapoi e whakahaere ana i te cytoskeleton tipu.
Horoihia te S. werraensis MK493-CF1 ki roto i te ipu Erlenmeyer 500 mL pohehe kei roto te 110 mL o te reo kakano kei roto 2% (w/v) galactose, 2% (w/v) Whakapiri Essence, 1% ( w/v) Bacto hanganga .-soyton (Thermo Fisher Scientific, Inc.), 0.5% (w / v) te tangohanga witi (KOGOSTCH Co., Ltd., Japan), 0.2% (w / v) (NH4) 2SO4 me te 0.2% CaCO3 i roto i te wai whakaheke.(pH 7.4 i mua i te whakahorotanga).Ko nga tikanga kakano i whakakororia ki runga i te wiriwiri hurihuri (180 rpm) i te 27°C mo nga ra e 2.Te whakatipu maara ma te FERMENTATION STOCK.Ko te ahurea purapura (7 ml) i whakawhitia ki roto i te ipu 500 ml K-1 kei roto te 40 g o te reo whakaputa me te 15 g o te parei kua pehia (MUSO Co., Ltd., Japan) me te 25 g o te wai kua whakakorehia (kaore te pH i whakaritea. i mua i te whakahorotanga).).I mahia te Fermentation i te 30°C i roto i te pouri mo nga ra 14.I tangohia te rauemi fermentation ki te 40 ml / pounamu EtOH me te centrifuged (1500 g, 4 ° C, 10 min).Ko te supernatant ahurea (60 ml) i tangohia me te ranunga o te 10% MeOH/EtOAc.I whakaetohia te paparanga pararopi i raro i te pehanga iti kia whiwhi toenga (59.5 mg), i tukuna ki te HPLC me te rourou rōnaki (0-10 meneti: 90%) i runga i te tīwae wāhanga whakamuri (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 μm, ID 10 mm × roa 250 mm) H2O/CH3CN, 10–35 meneti: 90% H2O/CH3CN ki te 70% H2O/CH3CN (rōnaki), 35–45 meneti: 90% H2O/EtOH, 45–155 meneti: 90% H2O / EtOH ki te 100% EtOH (rōnaki (rōnaki), 155-200 min: 100% EtOH) i te tere rere o te 1.5 ml / min, ko te coumamonamide (1, 36.0 mg) i wehea hei paura amorphous ma.
Kumamotoamide(1);1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6.93 (t, J = 2.5 Hz, 1H), 6.76 (dd, J = 4.3, 1.8 Hz 1H), 6.05 (t, J = 3.8 Hz, 1H).), 4.08 (s, 3H);13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δ 161.1, 121.0, 119.9, 112.2, 105.0, 68.3;ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ uara tatau: 141.0659, uara ine: 141.0663, IR νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593–1.33 cm
Ko nga kakano Columbia (Col-0) i riro mai i te Arabidopsis Biological Resource Centre (ABRC) me te whakaaetanga mo te whakamahi rangahau.Ko nga kakano Col-0 i whakatipuria, ka tiakina i raro i o maatau taiwhanga taiwhanga, ka whakamahia hei tipu araidopsis momo mohoao.Ko nga kakano Arabidopsis kua whakamaroketia ki te mata me te whakatipu i roto i te reo haurua Murashige me Skoog kei roto te 2% sucrose (Fujifilm Wako Pure Chemical), 0.05% (w/v) 2-(4-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) ( Fujifilm Wako Pure Chemical ).) me te 1.5% agar (Fujifilm Wako Pure Chemical), pH 5.7, i te 23 °C me te marama tonu.Ko nga kakano o te phs1-1 mutant i tukuna e T. Hashimoto (Nara Institute of Science and Technology).
Ko nga kakano o te riaka SR-1 i homai e T. Hashimoto (Nara Institute of Science and Technology) ka whakamahia hei tipu tupeka momo mohoao.Ko nga kakano tupeka ka werohia ki te mata, ka ruia ki te wai parakore mo nga po e toru hei whakatairanga i te whakatipu, katahi ka tuu ki roto i te wairewa haurua kaha kei roto 2% sucrose, 0.05% (w/v) MES, me te 0.8% gellan gum (Fujifilm Wako Pure Chemical) Murashige.me te reo Skoog) me te pH 5.7 ka whakakororia i te 23°C i raro i te marama tonu.
Ko te Strain Tak-1 na T. Kohchi (Te Whare Wananga o Kyoto) i whakamahia hei waahanga whakamatautau paerewa mo te rangahau liverwort.I whiwhihia te Gemma mai i nga tipu kua whakamarohia, katahi ka whakakikoruatia ki runga i te reo Gamborg B5 (Fujifilm Wako Pure Chemical) kei roto te 1% sucrose me te 0.3% kapia gellan ka whakakororia i te 23°C i raro i te marama tonu.
Tobacco BY-2 pūtau (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2) na S. Hasezawa (University of Tokyo).Ko nga pūtau BY-2 i diluted 95-fold i roto i te reo Linsmeier me Skoog kua whakarereketia me te taapiri ia wiki ki te waikawa 2,4-dichlorophenoxyacetic 32.Ko te whakatārewatanga pūtau i konatunatua ki runga i te wiriwiri hurihuri i te 130 rpm i te 27°C i roto i te pouri.Horoia nga pūtau kia 10 nga wa te nui o te reo hou, ka whakamau ano i te reo kotahi.BY-2 raina pūtau transgenic e whakaatu mau ana i te tohu microtubule TagRFP-TUA6 ranei te tohu kakawaea actin GFP-ABD2 i raro i te kareparāoa mosaic huaketo 35S kaiwhakatairanga i hangaia i te whakaahuatanga33,34,35.Ka taea te pupuri me te tukutahi enei raina pūtau ma te whakamahi i nga tikanga rite ki era i whakamahia mo te raina pūtau BY-2 taketake.
I whakatipuhia nga pūtau HeLa i roto i te Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) (Life Technologies) kua taapirihia ki te 10% serum bovine fetal, 1.2 U/ml penicillin, me te 1.2 μg/ml streptomycin i roto i te incubator 37°C me te 5% CO2.
Ko nga whakamatautau katoa i whakaahuahia i roto i tenei tuhinga i mahia i runga i nga ture me nga aratohu mo te haumaru koiora a Hapani.
I rewa nga puhui ki te dimethyl sulfoxide (DMSO; Fujifilm Wako Pure Chemical) hei rongoa kararehe ka diluted i roto i te reo MS mo te Arabidopsis me te tupeka, te reo Gamborg B5 ranei mo te liverwort.Mo te whakamatautau aukati i te tipu o te pakiaka, neke atu i te 10 nga kakano mo ia pereti i ruia ki runga i te reo agar kei roto nga puhui kua tohua, DMSO ranei.Ka ruia nga kakano ki roto i te ruma tipu mo te 7 ra.I whakaahuahia nga tipu ka inehia te roa o nga pakiaka.Mo te whakamatautau germination Arabidopsis, 48 nga kakano mo ia pereti i ruia ki runga i te reo agar e mau ana te 200 μM pūhui, DMSO ranei.I whakatipuria nga kakano Arabidopsis ki roto i te ruuma tipu ka tatauhia te maha o nga tipu kua tipu i te 7 ra i muri i te whakatipuranga (dag).Mo te whakamatautau mo te whakatipu tupeka, 24 nga kakano mo ia pereti i ruia ki runga i te reo agar e 200 μM KAND, DMSO ranei.Ka whakatipuria nga kakano tupeka ki roto i te ruuma tipu, ka tatauhia te maha o nga tipu kua tipu i muri i nga ra 14.Mo te whakamatautau aukati i te tipu ate, 9 nga kukune mai i ia pereti i whakakikoruatia ki runga i te reo agar kei roto nga tohu o te KAND, te DMSO ranei, ka whakakororia i roto i te ruma tipu mo te 14 ra.
Whakamahia nga tipu kua pania ki te 5 mg/ml propidium iodide (PI) hei whakaata i te whakahaerenga meristem pakiaka.Ko nga tohu PI i kitea e te karu kareoro ma te whakamahi i te karu matawai laser confocal TCS SPE (Leica Microsystems).
Ko te whakakikoruatanga o nga pakiaka ki te β-glucuronidase (GUS) i mahia i runga i te kawa i whakaahuatia e Malami me Benfey36.Ka whakatikahia nga tipu ki te 90% acetone i te po, ka pania ki te 0.5 mg/ml 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-d-glucuronic acid i roto i te GUS buffer mo te 1 haora ka tuu ki te wairewa chloraldehyde hydrated.(8 g chloral hydrate, 2 ml wai me 1 ml glycerol) ka kitea e te karu rereke rereke rereke ma te whakamahi i te miihini Axio Imager M1 (Carl Zeiss).
I inehia nga koki putake ki runga i nga tipu e 7-ra te pakeke i tipu ki runga i nga papaa poutū.Inehia te koki o te putake mai i te ahunga o te weriweri kaha e whakaahuatia ana i te taahiraa 6.
Ko te whakaritenga o nga microtubules cortical i kitea i runga i te korero, me nga whakarereketanga iti ki te kawa 37.Anti-β-tubulin antibody (KMX-1, Merk Millipore: MAB3408) me Alexa Fluor 488-conjugated anti-mouse IgG (Thermo Fisher Scientific: A32723) i whakamahia hei paturopi tuatahi me te tuarua i te 1:1000 me te 1:100 dilutions, ia.I riro mai nga whakaahua Fluorescence ma te whakamahi i te TCS SPE confocal laser scanning microscope (Leica Microsystems).Tikina nga whakaahua Z-stack me te hanga matapae kaha morahi kia rite ki nga tohutohu a te kaihanga.
I mahia te whakamatautau whakahiatotanga o nga pūtau HeLa ma te whakamahi i te Kete Tatau Pūtau 8 (Dojindo) e ai ki nga tohutohu a te kaihanga.
Ko te tipu o te E. coli DH5α i tātarihia ma te ine i te kiato pūtau i roto i te ahurea ma te whakamahi i te spectrophotometer i te 600 nm (OD600).
Ko te whakahaere o te Cytoskeletal i roto i nga pūtau BY-2 transgenic i kitea ma te whakamahi i te microscope fluorescence me te taputapu matawai confocal CSU-X1 (Yokogawa) me te kamera sCMOS (Zyla, Andor Technology).I aromatawaihia te kiato cytoskeletal e te tātari atahanga, i ine i te paheketanga o nga pika cytoskeletal i waenga i nga pika cytoplasmic i roto i nga whakaahua confocal ma te whakamahi i te rorohiko ImageJ i whakaahuatia38,39.
Hei kite i te mate o te pūtau i roto i nga pūtau BY-2, i whakakororiahia he aliquot o te whakatārewatanga pūtau ki te 0.05% Evans kahurangi mo te 10 meneti i te pāmahana rūma.Ko te tae kahurangi o Evans o nga pūtau mate ka whakawhirinaki ki te tangohanga o te waikano mai i nga pūtau whai oranga e te membrane plasma mau tonu40.I kitea nga pūtau kua pokea ma te whakamahi i te karuiti maramara (BX53, Olympus).
I tipuhia nga pūtau HeLa i roto i te DMEM me te 10% FBS i roto i te incubator whakamakuku i te 37 ° C me te 5% CO2.I tukinotia nga pūtau ki te 100 μM KAND 11, te waikawa kumamonamic 6, te kumamonamide 1, te 100 ng / ml colcemid (Gibco), te 100 ng / ml Nocodmaze (Sigma) ranei mo te 6 haora i te 37 ° C.I whakatauhia nga pūtau ki te MetOH mo te 10 meneti katahi me te acetate mo te 5 meneti i te pāmahana rūma.I incubated nga pūtau mau ki te β-tubulin antibody tuatahi (1D4A4, Proteintech: 66240-1) i diluted i roto i te 0.5% BSA/PBS mo te 2 haora, horoi 3 wa ki te TBST, ka incubated ki Alexa Fluor goat antibody.488 1 haora.– Kiore IgG (Thermo Fisher Scientific: A11001) me te 15 ng/ml 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) i diluted i te 0.5% BSA/PBS.Whai muri i te horoinga ki te TBST e toru nga wa, ka kitea nga pūtau poke i runga i te karuiti hurihuri Nikon Eclipse Ti-E.I hopukina nga whakaahua me te kamera Hamamatsu ORCA-R2 CCD kua whakamatao ma te whakamahi i te rorohiko MetaMorph (Ngā Pūrere Molecular).
Wā whakairinga: Hune-17-2024