Ko te tipu meristem apical (SAM) he mea nui mo te hoahoanga kakau. Nga homoni tipugiberellinKo nga (GA) e whai waahi nui ana ki te whakarite i te tipu o te tipu, engari kare tonu te maarama ki a raatau mahi i roto i te SAM. I konei, i whakawhanakehia e matou he kaikoiora ratiometric o te tohu GA ma te hangai i te pūmua DELLA hei pehi i tana mahi ture nui i roto i te whakautu whakawhiti GA i te wa e pupuri ana i tana paheketanga i runga i te mohiotanga GA. E whakaatu ana matou ko tenei kaikoiora-a-whakahekenga e tuhi tika ana i nga huringa o nga taumata GA me te mohiotanga pūkoro i te wa o te whanaketanga. I whakamahia e matou tenei koiora hei mapi i nga mahi tohu tohu GA i roto i te SAM. Ka whakaatuhia e matou ko nga tohu GA teitei kei roto i nga pūtau kei waenga i te okana primordia, he tohu tuatahi ki nga pūtau internode. Ma te whakamahi i nga huarahi whai hua me te ngaro-o-mahi, ka whakaatu ano matou ko te GA e whakahaere ana i te whakatakotoranga o te rererangi wehenga pūtau, te whakatuu i te whakahaere pūtau canonical o internodes, na reira e whakatairanga ana i nga tohu o roto i te SAM.
Ko te wana apical meristem (SAM), kei te tihi o te wana, kei roto i te kohanga o nga pūtau kakau e mahia ana e ratou nga whekau taha taha me nga pona kakau i roto i te ahua rereke me te huri haere puta noa i te oranga o te tipu. Ko ia o enei waeine tukurua, he pona tipu ranei, kei roto i nga whao me nga whekau taha taha o nga pona, me nga meristem axillary i roto i nga axils rau1. Ka huri te tipu me te whakaritenga o nga pona tipu i te wa o te whanaketanga. I roto i te Arabidopsis, ka pehia te tipu o roto i te wa o te tipu, ka noho moe tonu nga meristem axillary i roto i nga axils o nga rau rosette. I te wa o te whakawhiti ki te wahanga putiputi, ka noho te SAM hei meristem inflorescence, ka whakaputa i nga puku roa me nga puku axillary, nga manga i roto i nga axils o nga rau cauline, a muri iho, nga puawai kore rau2. Ahakoa kua tino ahu whakamua matou ki te mohio ki nga tikanga e whakahaere ana i te timatanga o nga rau, nga puawai, me nga manga, he iti noa te mohio mo te ahua o te tipu o te rua.
Ma te mohio ki te tohatoha mokowhiti o nga GA ka pai ake te mohio ki nga mahi o enei homoni i roto i nga momo kopa me nga waahanga whanaketanga rereke. Ko te tirohanga o te whakahekenga o te whakakotahitanga RGA-GFP e whakaatuhia ana i raro i te mahi a tana ake kaiwhakatairanga e whakarato ana i nga korero nui mo te whakaritenga o nga taumata GA katoa i roto i nga pakiaka15,16. Heoi ano, he rereke nga korero RGA puta noa i nga kopa17 ka whakatauhia e GA18. No reira, ko te whakaputanga rereke o te kaiwhakatairanga RGA ka puta pea te ahua o te rewharewha e kitea ana me te RGA-GFP na reira ehara tenei tikanga i te ine. No tata nei, ko te bioactive fluorescein (Fl)-labeled GA19,20 i whakaatu i te whakaemi o GA i roto i te endocortex pakiaka me te whakaritenga o ona taumata pūtau e te kawe GA. Ina tata nei, i whakaatu te GA FRET sensor nlsGPS1 he hono nga taumata GA me te whakaroanga o nga pūtau i roto i nga pakiaka, nga kakawaea, me nga hypocotyls21 kua tupu pouri. Heoi ano, kua kite matou, ehara ko te kukume GA anake te tawhā e whakahaere ana i nga mahi tohu tohu GA, na te mea kei te whakawhirinaki ki nga tikanga taapiri uaua. I konei, i runga i to maatau mohiotanga ki nga huarahi tohu DELLA me GA, ka ripoatahia e matou te whanaketanga me te tohu o te kaikoiora ratiometric e pa ana ki te whakahekenga mo te tohu GA. Hei whakawhanake i tenei kaikoiora ine ine, i whakamahia e matou he mutant GA-tairongo RGA i honoa ki te pūmua rewharewha me te whakaatu puta noa i roto i nga kopa, tae atu ki te pūmua rewharewha-kore-GA. Ka whakaatuhia e matou ko nga whakakotahitanga pūmua RGA mutant e kore e whakararu i te tohu GA endogenous i te wa e whakaatuhia ana i nga wa katoa, a ka taea e tenei kaikoiora te tatau i nga mahi tohu ka puta mai i te whakaurunga GA me te tukatuka tohu GA e te taputapu sensing me te taumira mokowhiti teitei. I whakamahia e matou tenei koiora hei mahere i te tohatoha mokowhiti o te mahi tohu GA me te tatau me pehea te whakahaere a GA i te whanonga pūkoro i roto i te SAM epidermis. E whakaatu ana matou ko te GA e whakahaere ana i te whakatakotoranga o te rererangi wehenga o nga pūtau SAM kei waenga i te okana primordia, na reira ka whakatauhia te whakahaeretanga pūtau canonical o te internode.
Ka mutu, i patai atu mena ka taea e te qmRGA te whakaatu i nga huringa o nga taumata GA endogenous ma te whakamahi i nga hypocotyls tipu. I whakaatuhia e matou i mua ko te pakawa e whakaihiihi ana i te tipu ma te whakanui ake i te whakahiato GA me te hekenga DELLA34. Na reira, i kite matou ko te roa o te hypocotyl i roto i nga tipu pUBQ10::qmRGA i tupu i raro i te nui o te tuku pākawa (10 mM NO3−) he tino roa ake i tera o nga tipu i tipu i raro i nga tikanga kore-pakawa (Taapiri Fig. 6a). I te rite ki te urupare tipu, he nui ake nga tohu GA i roto i nga hypocotyls o nga tipu i tupu i raro i nga tikanga 10 mM NO3− i nga tipu i tipu i te kore o te nitrate (Taupiri Fig. 6b, c). No reira, ka taea ano e te qmRGA te aro turuki i nga huringa o te tohu tohu GA na nga huringa endogenous i roto i te kukū GA.
Kia mohio ai mena ko te mahi tohu tohu GA i kitea e te qmRGA ka whakawhirinaki ki te kukū o te GA me te tirohanga GA, i runga i te whakaaro i runga i te hoahoa puoro, i tātarihia e matou te korero o nga kaiwhakawhiwhi GID1 e toru i roto i nga kopa tipu me te whanau. I roto i nga tipu, i whakaatuhia e te rarangi kairipoata GID1-GUS ko te GID1a me te c i tino whakaatuhia i roto i nga cotyledons (Fig. 3a-c). I tua atu, ko nga kaiwhiwhi e toru i whakaatuhia i roto i nga rau, i te taha o te taha o te pakiaka pakiaka, i nga tohutohu pakiaka (haunga mo te potae pakiaka o GID1b), me te punaha vascular (Fig. 3a-c). I roto i te inflorescence SAM, i kitea e matou nga tohu GUS anake mo GID1b me 1c (Taupiri Fig. 7a-c). In situ hybridization i whakapumau i enei tauira korero me te whakaatu ano ko te GID1c i whakaatuhia i nga taumata iti i roto i te SAM, engari ko te GID1b i whakaatu teitei ake i te taha o te SAM (Taupiri Fig. 7d-l). Ko te pGID1b:: 2xmTQ2-GID1b whakawhitinga whakamaoritanga i whakaatu ano i te awhe kua tohua o te whakaaturanga GID1b, mai i te iti, te kore korero ranei i waenganui o te SAM ki te korero teitei i nga rohe okana (Taupiri Fig. 7m). No reira, kaore i te tohatohahia nga kaiwhakawhiwhi GID1 puta noa i roto i nga kopa. I roto i nga whakamatautau i muri mai, i kite ano matou ko te korero nui o te GID1 (pUBQ10 :: GID1a-mCherry) i piki ake te kaha o te qmRGA i roto i nga hypocotyls ki te tono GA o waho (Fig. 3d, e). I te rereke, ko te rewharewha i inehia e te qd17mRGA i roto i te hypocotyl he koretake ki te maimoatanga GA3 (Fig. 3f, g). Mo nga whakamatautau e rua, i tukinotia nga tipu me nga kohinga teitei o GA (100 μM GA3) ki te aromatawai i te whanonga tere o te puoro, i te mea i whakareihia, i ngaro ranei te kaha ki te here ki te kaiwhiwhi GID1. Ko enei hua ka whakapumau ko te qmRGA biosensor e mahi ana i te mahi whakakotahi hei puoro GA me te GA, me te kii ka taea e te whakaputanga rereke o te kaiwhiwhi GID1 te whakarereke i te kaha o te pukoro.
I tenei wa, ko te tohatoha o nga tohu GA i roto i te SAM kei te noho marama. Na reira, i whakamahia e matou nga tipu korero qmRGA me te pCLV3::mCherry-NLS stem cell reporter35 ki te tatau i nga mahere ine teitei o te mahi tohu GA, e arotahi ana ki te paparanga L1 (epidermis; Fig. 4a, b, tirohia Nga Tikanga me nga Tikanga Tāpiri), na te mea he mahi nui a L1 ki te whakahaere i te tipu SAM36. I konei, pCLV3::mCherry-NLS whakapuakitanga i homai he tohu tohutoro ahuahanga mo te wetewete i te tohatoha mokowhiti o te mahi tohu GA37. Ahakoa e kiia ana he mea nui a GA mo te whakawhanaketanga o te okana taha4, i kite matou he iti nga tohu GA i roto i te tipu o te putiputi (P) timata mai i te wahanga P3 (Fig. 4a, b), i te mea he ahua ngawari nga mahi a nga taitamariki P1 me P2 primordiums rite ki tera i te rohe o waenganui (Fig. 4a, b). Ko nga mahi tohu tohu GA teitei ake i kitea i nga rohe o te okana primordium, timata mai i te P1 / P2 (i nga taha o te rohe) me te tihi i te P4, me nga ruma katoa o te rohe o te rohe kei waenganui i te primordia (Fig. 4a, b me te Tāpiri 8a, b). Ko tenei mahi tohu GA teitei ake i kitea i roto i te epidermis engari ano hoki i roto i te L2 me nga paparanga L3 o runga (Taupiri 8b). Ko te tauira o nga tohu GA i kitea i roto i te SAM e whakamahi ana i te qmRGA i noho tonu i te wa roa (Taupiri Fig. 8c-f, k). Ahakoa ko te hanga qd17mRGA i whakahekehia i roto i te SAM o nga tipu T3 mai i nga rarangi motuhake e rima e tohuhia ana e matou i roto i nga korero, i taea e matou te tarai i nga tauira rererangi i whiwhi ki te pRPS5a :: VENUS-2A-TagBFP hanga (Taupiri Fig. 8g-j, l). I roto i tenei raina whakahaere, he iti noa nga huringa i roto i te tauwehenga fluorescence i kitea i roto i te SAM, engari i roto i te pokapū SAM i kite matou i te heke marama me te kore ohorere i roto i te VENUS e hono ana ki a TagBFP. Ko tenei e whakapumau ana ko te tauira tohu e kitea ana e te qmRGA e whakaatu ana i te whakahekenga a te GA-whakaaro o te mRGA-VENUS, engari e whakaatu ana ano ka taea e te qmRGA te whakanui ake i nga mahi tohu GA i roto i te pokapū meristem. Hei whakarāpopototanga, ka whakaatuhia e o maatau hua he tauira tohu tohu GA e whakaatu ana i te tohatoha o te primordia. Ko tenei tohatoha o te rohe-a-waahanga (IPR) na te mea i te wa o te whakatuutanga o nga mahi tohu GA teitei i waenga i te whanaketanga o te primordium me te rohe o te pokapū, i te wa ano ka heke te mahi tohu GA i roto i te primordium (Fig. 4c, d).
Ko te tohatoha o nga kaiwhakawhiwhi GID1b me GID1c (tirohia i runga ake nei) e tohu ana ko te whakaatu rereke o nga kaiwhakawhiwhi GA ka awhina i te ahua o te mahi tohu GA i roto i te SAM. I whakaaro matou mehemea ka uru mai pea te kohinga rereke o GA. Hei tirotiro i tenei tupono, i whakamahia e matou te nlsGPS1 GA FRET sensor21. Ko te nui ake o te kaha o te whakahohe i kitea i roto i te SAM o nlsGPS1 i tukinotia ki te 10 μM GA4 + 7 mo te 100 min (Taupiri Fig. 9a-e), e tohu ana ka whakautu a nlsGPS1 ki nga huringa o te kukū GA i roto i te SAM, pera i roto i nga roots21. Ko te tohatoha mokowhiti o te auau whakahohenga nlsGPS1 i whakaatu i nga taumata iti o te GA i roto i nga papa o waho o te SAM, engari i whakaatu i te mea kua piki ake ki te pokapū me nga rohe o te SAM (Fig. 4e me te Tāpiri 9a, c). Ko tenei e tohu ana ka tohatohahia ano a GA i roto i te SAM me te tauira mokowhiti e rite ana ki tera i whakaatuhia e qmRGA. Hei huarahi taapiri, i tukuna ano e matou te SAM me te GA rewharewha (GA3-, GA4-, GA7-Fl) ko Fl anake hei mana kino. I tohatohahia te tohu Fl puta noa i te SAM, tae atu ki te rohe pokapū me te primordium, ahakoa he iti ake te kaha (Whakaahua 4j me te Whakaaturanga 10d). Engari, ko nga GA-Fl e toru i whakaemi motuhake i roto i nga rohe o mua me nga nekehanga rereke i roto i te toenga o te IPR, me te GA7-Fl e kohikohi ana i roto i te rohe nui rawa atu i roto i te IPR (Fig. 4k and Supplementary Fig. 10a, b). Ko te inenga o te kaha o te rewharewha i whakaatu ko te IPR ki te kore-IPR te kaha o te kaha i runga ake i te GA-Fl-treated SAM i whakaritea ki te Fl-treated SAM (Fig. 4l and Supplementary Fig. 10c). Ko enei hua e whakaatu ana kei te noho a GA i nga taumata teitei ake i roto i nga pūtau IPR e tata ana ki te rohe okana. E tohu ana tenei ko te tauira o te mahi tohu SAM GA ka puta mai i nga korero rereke e rua o nga kaiwhakawhiwhi GA me te kohinga rereke o GA i roto i nga ruma IPR tata ki nga rohe okana. Na, i whakaatuhia e to maatau rangahau he tauira mokowhiti ohorere o te tohu GA, me te iti ake o nga mahi i roto i te pokapū me te primordium o te SAM me nga mahi teitei ake i roto i te IPR i te rohe o te rohe.
Kia mohio ai matou ki te mahi o te mahi tohu tohu GA rerekee i roto i te SAM, i tātarihia e matou te hononga i waenga i te mahi tohu tohu GA, te roha o te pūtau, me te wehenga pūtau ma te whakamahi i nga whakaahua wa-waahi o te SAM qmRGA pCLV3::mCherry-NLS. I runga i te mahi a te GA i roto i nga ture whakatipu, i tumanakohia he hononga pai me nga tawhā roha pūtau. Na reira, i whakatairitehia e matou nga mahere mahi tohu GA i te tuatahi me nga mapi o te reiti tipu o te mata o te mata (hei takawaenga mo te kaha o te roha o te pūtau mo tetahi pūtau me nga pūtau tamahine i te wehenga) me nga mapi o te anisotropy tipu, e ine ana i te ahunga o te roha pūtau (e whakamahia ana hoki i konei mo tetahi pūtau me nga pūtau tamahine i te wehenga; Fig. 5a,b, tirohia Nga Tikanga me nga Tikanga Tāpiri). Ko o maatau mapi o te tere o te tipu o te mata o te SAM e rite ana ki nga tirohanga o mua38,39, me te iti o te tipu o te tipu i te rohe me te nui o te tipu o te tipu i roto i te tipu o nga puawai (Fig. 5a). Ko te tātari wae matua (PCA) i whakaatu ko te mahi tohu tohu GA he kino te hono ki te kaha o te tipu o te mata o te mata (Whakaahua 5c). I whakaatuhia ano e matou ko nga toki matua o te rereketanga, tae atu ki te whakauru tohu tohu GA me te kaha o te tipu, he orthogonal ki te ahunga i whakatauhia e te korero CLV3 teitei, e whakapumau ana i te whakakore i nga pūtau mai i te pokapū SAM i roto i nga toenga o nga tātaritanga. I whakapumauhia e Spearman correlation analysis nga hua PCA (Whakaahua 5d), e tohu ana ko nga tohu GA teitei ake i roto i te IPR kaore i puta te pikinga ake o te tipu o te pūtau. Heoi ano, i kitea e te tātari hononga he paku pai te hononga i waenga i te mahi tohu tohu GA me te anisotropy tipu (Whakaahua 5c, d), e kii ana ko te tohu GA teitei ake i roto i te IPR ka awe i te ahunga o te tipu o te pūtau me te waahi pea o te rererangi wehenga pūtau.
a, b Ko nga mahere wera o te tipu o te mata toharite (a) me te anisotropy tipu (b) i roto i te SAM i neke atu i nga tipu motuhake e whitu (i whakamahia hei takawaenga mo te kaha me te ahunga o te roha pūtau, ia). Ko te tātaritanga PCA ko nga taurangi e whai ake nei: te tohu GA, te kaha o te tipu o te mata, te anisotropy tipu mata, me te whakaaturanga CLV3. Ko te waahanga PCA 1 i te nuinga o te wa i hono kino ki te kaha o te tipu o te mata me te pai o te hono ki te tohu GA. Ko te waahanga PCA 2 he pai te hono ki te anisotropy tipu o te mata me te kino ki te korero CLV3. Ko nga ōrau e tohu ana i te rereketanga e whakamaramahia ana e ia waahanga. d Spearman tātari hononga i waenga i te tohu GA, te kaha o te tipu o te mata, me te anisotropy tipu o te mata i te tauine kiko kaore i te CZ. Ko te tau kei te taha matau ko te uara Spearman rho i waenga i nga taurangi e rua. Ko nga whetūriki e tohu ana i nga keehi he mea tino nui te honotanga/te hononga kino. e Tirohanga Ahu-3 o nga pūtau Col-0 SAM L1 na roto i te maru whakaata. Ko nga pakitara pūtau hou i hangaia i roto i te SAM (engari ehara i te primordium) i te 10 haora ka tae te tae ki o raatau uara koki. Ka whakaatuhia te pae tae ki te kokonga matau o raro. Ko te whakaurunga e whakaatu ana i te ahua 3D i te 0 haora. I tuaruatia te whakamatautau me nga hua rite. f Ko nga papa pouaka e whakaatu ana i nga reiti wehewehenga pūtau i roto i te IPR me te kore-IPR Col-0 SAM (n = 10 tipu motuhake). Ko te raina waenga e whakaatu ana i te tauwaenga, ko nga rohenga pouaka e tohu ana i te 25 me te 75 o te ōrau. Ko nga whiskers e tohu ana i nga uara iti me te uara teitei kua whakatauhia me te rorohiko R. I whiwhi uara P me te whakamatautau-t-rua a Welch. g, h Ko te hoahoa hoahoa e whakaatu ana (g) me pehea te ine i te koki o te pakitara hou (magenta) e pa ana ki te ahunga radial mai i te pokapū o te SAM (raina iraira ma) (ko nga uara koki whakapeka anake, ara, 0–90°, ka whakaarohia), me te (h) nga aronga porohita/te taha me te torotoro i roto i te meristem. i Te auautanga o te whakatakotoranga rererangi wehenga pūtau puta noa i te SAM (puru pouri), IPR (puru reo), me te IPR-kore (puru marama). Ko nga uara P i whiwhihia e te whakamatautau Kolmogorov-Smirnov e rua-hiku. I tuaruatia te whakamatautau me nga hua rite. j Te auautanga o te whakawehenga o te rerenga rererangi o te IPR huri noa i te P3 (marama matomato), P4 (waenganui kaakaariki), me te P5 (pouri kakariki). Ko nga uara P i whiwhihia e te whakamatautau Kolmogorov-Smirnov e rua-hiku. I tuaruatia te whakamatautau me nga hua rite.
Na reira, i tirotirohia e matou i muri mai te hononga i waenga i te tohu GA me te mahi wehenga pūtau ma te tautuhi i nga pakitara hou i hangaia i te wa o te whakamatautau (Fig. 5e). Na tenei huarahi i taea e matou te ine i te auau me te ahunga o te wehenga pūtau. He mea whakamiharo, i kitea e matou he rite tonu te auau o nga wehenga o te pūtau i roto i te IPR me te toenga o te SAM (kaore i te IPR, Fig. 5f), e tohu ana ko nga rereketanga o te tohu GA i waenga i te IPR me nga kamera kore-IPR e kore e tino pa ki te wehenga pūtau. Ko tenei, me te hononga pai i waenga i te tohu GA me te tipu anisotropy, i akiakihia matou ki te whakaaro mehemea ka taea e te mahi tohu tohu GA te awe i te takotoranga o te rererangi wehenga pūtau. I whangangahia e matou te takotoranga o te pakitara o te pūtau hou hei koki whakapeka e pa ana ki te tuaka radial e hono ana i te pokapū meristem me te pokapū o te pakitara pūtau hou (Fig. 5e-i) me te kite i te ahua marama mo nga pūtau ki te wehewehe i nga koki tata ki te 90° e pa ana ki te tuaka radial, me te teitei o te waa i kitea i te 7030.80° me te 703.80°. (22.62%) (Fig. 5e,i), e hāngai ana ki nga wehenga pūtau i te ahunga porohita / whakawhiti (Fig. 5h). Hei tirotiro i te takoha o te tohu GA ki tenei whanonga wehenga pūtau, i tātarihia e matou nga tawhā wehenga pūtau i roto i te IPR me te kore-IPR motuhake (Fig. 5i). I kite matou he rereke te tohatoha koki wehenga i roto i nga ruma IPR i tera i roto i nga kamera kore-IPR, i roto ranei i nga ruma i roto i te SAM katoa, me nga kamera IPR e whakaatu ana i te waahanga teitei ake o nga wehenga o te taha taha / porohita, ara, 70-80 ° me 80-90 ° (33.86% me te 30.71%, ia, Fig .5). Na, i kitea e o maatau tirohanga he hononga i waenga i te tohu GA teitei me te waahi rererangi wehenga pūtau tata ki te ahunga porohita, he rite ki te hononga i waenga i te mahi tohu GA me te anisotropy tipu (Fig. 5c, d). Hei whakapumau ake i te tiaki mokowhiti o tenei hononga, i inehia e matou te waahanga rererangi wehewehe i roto i nga ruma IPR e karapoti ana i te primordium timata mai i te P3, mai i te mea kua kitea te mahi tohu tohu GA teitei i tenei rohe timata mai i te P4 (Fig. 4). Ko nga koki wehenga o te IPR huri noa i te P3 me te P4 karekau he rereketanga o te tatauranga, ahakoa he nui ake te auau o nga wehenga pūtau taha taha i kitea i roto i te IPR huri noa i te P4 (Fig. 5j). Heoi, i roto i nga ruma IPR huri noa i te P5, ko te rereketanga i roto i te takotoranga o te rererangi wehenga pūtau ka tino nui ki te tatauranga, me te tino piki ake o te auau o nga wehewehenga whakawhiti (Fig. 5j). Ko enei hua e whakaatu ana ka taea e te tohu GA te whakahaere i te whakatakotoranga o nga wehenga pūtau i roto i te SAM, e rite ana ki nga purongo o mua40,41 ka taea e te tohu GA teitei te whakauru i te taha taha o nga wehenga pūtau i roto i te IPR.
E matapaehia ana ka kore e whakauruhia nga pūtau i roto i te IPR ki te primordia engari ki roto i nga internodes2,42,43. Ko te takotoranga whakawhiti o nga wehenga pūtau i roto i te IPR ka puta pea he whakaritenga angamaheni o nga rarangi roa whakarara o nga pūtau epidermal i roto i nga waahanga. Ko o maatau kitenga i runga ake nei e kii ana ka whai waahi te tohu tohu GA ki tenei mahi ma te whakahaere i te ahunga o te wehenga pūtau.
Ko te ngaronga o te mahi o te maha o nga ira DELLA ka puta he whakautu GA, ka taea te whakamahi i nga mutant della ki te whakamatautau i tenei whakapae44. I te tuatahi i tātarihia e matou nga tauira korero o nga ira DELLA e rima i roto i te SAM. Ko te whakawhitinga whakawhitinga o te GUS line45 i whakaatu ko GAI, RGA, RGL1, me RGL2 (ki te iti ake o te waahanga) i whakaatuhia i roto i te SAM (Taupiri Fig. 11a-d). Ko te whakakotahitanga o te waahi i whakaatu ake ko te GAI mRNA e whakaemi ana i roto i te primordia me te whakawhanake i nga puawai (Taapiri Fig. 11e). Ko te RGL1 me te RGL3 mRNA i kitea puta noa i te SAM canopy me nga puawai tawhito, engari ko te RGL2 mRNA he nui ake i te rohe rohe (Taapiri Whakaatu 11f-h). Ko te whakaahuatanga o te pRGL3 :: RGL3-GFP SAM i whakapumau i te korero i kitea e te in situ hybridization me te whakaatu ko te RGL3 pūmua e whakaemi ana ki te pokapū o te SAM (Taupiri Fig. 11i). Ma te whakamahi i te raina pRGA :: GFP-RGA, i kitea ano e matou ko te RGA pūmua e whakaemi ana i roto i te SAM, engari ka heke tona nui i te rohe ka timata mai i te P4 (Taupiri Fig. 11j). Ko te mea nui, ko nga tauira korero o te RGL3 me te RGA e rite ana ki nga mahi tohu GA teitei ake i roto i te IPR, i kitea e te qmRGA (Fig. 4). I tua atu, ko enei raraunga e tohu ana ko nga DELLA katoa e whakaatuhia ana i roto i te SAM, a, ko o raatau korero ka puta i te SAM katoa.
I muri mai ka tātarihia e matou nga tawhā wehenga pūtau i roto i te momo mohoao SAM (Ler, mana) me te gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 della quintuple (ao) mutants (Fig. 6a, b). Ko te mea whakamiharo, i kite matou i te nekehanga nui o te tatauranga i roto i te tohatoha o nga rerenga koki wehenga pūtau i roto i te della global mutant SAM i whakaritea ki te momo mohoao (Fig. 6c). Ko tenei huringa i roto i te della global mutant na te piki ake o te auau o nga koki 80-90 ° (34.71% ki te 24.55%), me te iti ake, ko te 70-80 ° nga koki (23.78% ki te 20.18%), ara, e rite ana ki nga wehenga pūtau whakawhiti (Fig. 6c). Ko te auau o nga wehenga kore-whakawhiti (0-60 °) he iti ake ano i roto i te della global mutant (Fig. 6c). Ko te auau o nga wehenga pūtau whakawhiti kua tino piki ake i roto i te SAM o te della global mutant (Fig. 6b). Ko te auau o nga wehenga pūtau whakawhiti i roto i te IPR i teitei ake i roto i te della global mutant whakaritea ki te momo mohoao (Fig. 6d). I waho o te rohe IPR, he rite tonu te tohatoha o te momo mohoao o nga koki wehenga pūtau, engari ko te della global mutant e pai ana ki nga wehenga paanui penei i te IPR (Fig. 6e). I tohua ano e matou te takotoranga o nga wehenga pūtau i roto i te SAM o te ga2 oxidase (ga2ox) quintuple mutants (ga2ox1-1, ga2ox2-1, ga2ox3-1, ga2ox4-1, me te ga2ox6-2), he papamuri mutant GA-kore e whakaemi ana a GA. I rite ki te pikinga o nga taumata GA, ko te SAM o te quintuple ga2ox mutant inflorescence he nui ake i tera o Col-0 (Taupiri Fig. 12a, b), ka whakaritea ki te Col-0, ko te quintuple ga2ox SAM i whakaatu he rereke rereke te tohatoha o nga koki wehenga pūtau, me te piki ake o te auau koki mai i te 50°ing ki te 90°ing whakawehenga. 12a–c). No reira, ka whakaatuhia e matou ko te whakahoahoatanga o te tohu tohu GA me te whakaemi GA ka whakaawe i nga wehewehenga o nga pūtau taha taha i roto i te IPR me te toenga o te SAM.
a, b te tirohanga 3D o te paparanga L1 o te PI-stained Ler (a) me te ao della mutant (b) SAM ma te whakamahi i te microscopy confocal. Ko nga pakitara hou i hangaia i roto i te SAM (engari ehara i te primordium) i roto i te 10-haora ka whakaatuhia me te tae ki runga i o raatau uara koki. Ko te whakaurunga e whakaatu ana i te SAM i te 0 haora. Ka whakaatuhia te pae tae ki te kokonga matau o raro. Ko te pere i roto i te (b) e tohu ana ki tetahi tauira o nga konae pūtau tiaro i roto i te ao della mutant. I tuaruatia te whakamatautau me nga hua rite. ce whakatairite o te tohatoha auau o nga waahanga rererangi wehenga pūtau i roto i te SAM katoa (d), IPR (e), me te kore-IPR (f) i waenga i a Ler me te ao della. I whiwhi nga uara P ma te whakamahi i te whakamatautau Kolmogorov-Smirnov e rua-hiku. f, g Tirohanga 3D o nga whakaahua whakapouri o te SAM kua pokea-PI o Col-0 (i) me pCUC2::gai-1-VENUS (j) tipu whakawhiti. Ko nga panui (a, b) e whakaatu ana i nga pakitara hou (engari ehara i te primordia) i hangaia i roto i te SAM i roto i te 10 haora. I tuaruatia te whakamatautau me nga hua rite. h–j Te whakatairitenga o te tohatoha auau o nga waahanga rererangi wehenga pūtau kei roto i te katoa o te SAM (h), IPR (i) me te IPR-kore (j) i waenga i nga tipu Col-0 me pCUC2::gai-1-VENUS. I whiwhi nga uara P ma te whakamahi i te whakamatautau Kolmogorov-Smirnov e rua-hiku.
I muri mai ka whakamatauhia e matou te paanga o te aukati i nga tohu tohu GA i roto i te IPR. I tenei mutunga, i whakamahia e matou te kaiwhakatairanga kapu cotyledon 2 (CUC2) ki te akiaki i te whakaputanga o te pūmua gai-1 kino nui kua honoa ki VENUS (i te raina pCUC2::gai-1-VENUS). I roto i te momo mohoao SAM, ka peia e te kaiwhakatairanga CUC2 te whakaaturanga o te nuinga o nga IPR i roto i te SAM, tae atu ki nga pūtau taitapa, mai i te P4 ki runga ake, me nga korero motuhake i kitea i roto i nga tipu pCUC2 :: gai-1-VENUS (tirohia i raro). Ko te tohatoha o nga koki wehenga pūtau puta noa i te SAM, IPR ranei o te pCUC2 :: gai-1-VENUS tipu kaore i tino rereke mai i te momo mohoao, ahakoa i te ohorere ka kitea e matou ko nga pūtau kaore he IPR i roto i enei tipu ka wehewehea ki te teitei ake o te 80-90 ° (Fig. 6f-j).
E ai ki te whakaaro ko te ahunga o te wehenga pūtau e whakawhirinaki ana ki te ahuahanga o te SAM, ina koa ko te ahotea i puta mai i te kopikopiko o te kiko46. Na reira i patai atu mena kua whakarerekehia te ahua o te SAM i roto i te della global mutant me nga tipu pCUC2:: gai-1-VENUS. Ka rite ki te korero i mua12, ko te rahi o te della global mutant SAM he nui ake i tera o te momo mohoao (Taapiri Fig. 13a, b, d). In situ hybridization o CLV3 me STM RNA whakapumautia te roha meristem i della mutants me te whakaatu ano te roha taha o te kohanga pūtau kakau (Taupiri Fig. 13e, f, h, i). Heoi ano, he rite te ahua o te SAM ki nga momo momo momo e rua (Taupiri Fig. 13k, m, n, p). I kite matou i te pikinga rite o te rahi i roto i te gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 della quadruple mutant kahore he huringa o te curvature i whakaritea ki te momo mohoao (Taupiri Fig. 13c, d, g, j, l, o, p). Ko te auau o te wahanga wehenga pūtau i pa ki roto i te della quadruple mutant, engari he iti ake i te della monolithic mutant (Taupiri Fig. 12d-f). Ko tenei paanga o te inenga, me te kore o te paanga ki runga i te kopikopiko, e kii ana ko te toenga o nga mahi RGL3 i roto i te Della quadruple mutant ka whakawhāiti i nga huringa i roto i te wahanga wehenga pūtau na te ngaronga o te mahi DELLA me nga huringa o nga wehenga pūtau taha taha ka puta hei whakautu ki nga huringa o te mahi tohu GA, kaua ki nga huringa o te ahuahanga SAM. Ka rite ki te korero i runga ake nei, ka peia e te kaiwhakatairanga CUC2 te whakaaturanga IPR i roto i te SAM ka timata i te P4 (Taupiri Fig. 14a, b), me te rereke, ko te pCUC2 :: gai-1-VENUS SAM he iti te rahi engari he teitei ake te curvature (Taupiri Fig. 14c-h). Ko tenei huringa i roto i te pCUC2::gai-1-VENUS SAM morphology ka puta he rerekee te tohatoha o nga taumahatanga miihini ka whakaritea ki te momo mohoao, ka timata nga taumahatanga porohita teitei i te tawhiti poto atu i te pokapū SAM47. I tua atu, ko nga huringa i roto i te pCUC2:: gai-1-VENUS SAM morphology ka puta mai i nga huringa o nga taonga miihini a-rohe i whakaawehia e te whakawhitinga whakawhitinga48. I roto i nga take e rua, ka taea e tenei te whakakore i nga paanga o nga huringa o te tohu GA ma te whakanui ake i te tupono ka wehewehe nga pūtau i roto i te toronga porohita/whakawhiti, e whakamarama ana i o maatau tirohanga.
Ka huihuia, ka whakauhia e o maatau raraunga ko te tohu tohu GA teitei ake e whai waahi kaha ana ki te taha taha o te rererangi wehenga pūtau i roto i te IPR. E whakaatu ana hoki ko te kopikopiko meristem he awe hoki i te takotoranga o te rererangi wehenga pūtau i roto i te IPR.
Ko te whakawhitinga whakawhiti o te rererangi wehewehe i roto i te IPR, na te nui o te mahi tohu tohu GA, e kii ana ko GA i mua i te whakarite i te konae pūtau radial i roto i te epidermis i roto i te SAM ki te tautuhi i te whakahaere waea ka kitea i muri mai i roto i te epidermal internode. Inaa, he maha nga wa ka kitea nga konae waea i roto i nga whakaahua SAM o della mutants ao (Fig. 6b). Na, ki te tuhura ake i te mahi whakawhanaketanga o te tauira mokowhiti o te tohu GA i roto i te SAM, i whakamahia e matou te whakaahua-waahi ki te tarai i te whakahaere mokowhiti o nga pūtau i roto i te IPR i roto i te momo mohoao (Ler me Col-0), della mutants ao, me te pCUC2:: gai-1-VENUS tipu transgenic.
I kitea e matou ko te qmRGA i whakaatu ko te mahi tohu GA i roto i te IPR i piki ake i te P1 / P2 ka eke ki te P4, a ka noho tonu tenei tauira i te wa (Fig. 4a-f me te Whakaaturanga 8c-f, k). Hei tātari i te whakaritenga mokowā o ngā pūtau i roto i te IPR me te whakanui ake i te tohu GA, i tapaina e matou nga pūtau Ler IPR ki runga ake me nga taha o te P4 e ai ki o raatau whanaketanga i tātarihia i te 34 haora i muri i te tirohanga tuatahi, ara, neke atu i te rua nga wa plastid, ka taea e maatau te whai i nga pūtau IPR i te wa o te whanaketanga o mua mai i te P1/P2 ki te P4. E toru nga tae rereke i whakamahia e matou: he kowhai mo aua ruma i whakauruhia ki roto i te primordium e tata ana ki te P4, he kakariki mo te hunga i roto i te IPR, he papura mo te hunga i uru ki nga mahi e rua (Fig. 7a–c). I te t0 (0 h), ka kitea nga paparanga 1-2 o nga pūtau IPR i mua o P4 (Fig. 7a). Ka rite ki te whakaaro, i te wa e wehewehea ana enei ruma, ka pera te nuinga ma te rererangi wehenga whakawhiti (Fig. 7a–c). He rite nga hua i puta ma te whakamahi i te Col-0 SAM (e aro ana ki te P3, he rite tonu tana taitapa ki te P4 i Ler), ahakoa i roto i tenei momo momo ko te kopaki i hanga ki te taitapa putiputi i huna tere ake nga ruma IPR (Fig. 7g–i). Na, ko te tauira wehewehe o nga pūtau IPR i mua i te whakarite i nga pūtau ki nga rarangi radial, penei i roto i nga internodes. Ko te whakaritenga o nga rarangi radial me te waahitanga o nga pūtau IPR i waenga i nga whekau whai muri e tohu ana ko enei pūtau he tipuna i roto i te internodal.
I konei, i whakawhanakehia e matou he kaioraora tohu tohu GA ratiometric, qmRGA, e taea ai te mapi ine ine o nga mahi tohu GA i puta mai i te whakakotahitanga o te GA me te GA kaiawhina i te wa e whakaiti ana i te pokanoa ki nga huarahi tohu mutunga, na reira ka tuku korero mo te mahi GA i te taumata pūkoro. I tenei mutunga, i hangaia e matou he pūmua DELLA kua whakarereketia, mRGA, kua ngaro te kaha ki te here i nga hoa taunekeneke DELLA engari kei te noho tairongo ki te proteolysis a GA-induced. Ka whakautu a qmRGA ki nga huringa o waho me nga huringa mutunga i roto i nga taumata GA, a ko ona ahuatanga hihiri ka taea te aromatawai i nga huringa mokowhiti i roto i nga mahi tohu GA i te wa o te whanaketanga. Ko te qmRGA ano he taputapu tino ngawari na te mea ka taea te urutau ki nga momo kopa rereke ma te whakarereke i te kaiwhakatairanga e whakamahia ana mo tana whakaaturanga (mehemea e tika ana), me te ahua o te ahua o te huarahi tohu GA me te kaupapa PFYRE puta noa i nga angiosperms, ka taea pea te whakawhiti ki etahi atu momo22. I runga ano i tenei, he rerekee rite i roto i te raihi SLR1 DELLA pūmua (HYY497AAA) i whakaatuhia hoki ki te pehi i te mahi aukati tipu o SLR1 i te mea he iti noa iho te whakahekenga o te hekenga takawaenga GA, he rite ki te mRGA23. Ko te mea nui, ko nga rangahau hou i roto i te Arabidopsis i whakaatu ko te huringa waikawa amino kotahi i roto i te rohe PFYRE (S474L) i whakarereke i te mahi tuhi o te RGA me te kore e pa ki tona kaha ki te taunekeneke me nga hoa mahi tuhi50. Ahakoa he tata rawa tenei huringa ki nga whakakapinga waikawa amino e 3 kei roto i te mRGA, ka whakaatu a maatau rangahau ko enei huringa e rua ka whakarereke i nga ahuatanga motuhake o DELLA. Ahakoa ka herea te nuinga o nga hoa tauwehe tuhi ki nga rohe LHR1 me SAW o DELLA26,51, ko etahi waikawa amino kua tiakina i roto i te rohe PFYRE ka awhina i enei taunekeneke.
Ko te whakawhanaketanga o roto he ahuatanga nui o te hoahoanga tipu me te whakapai ake i nga hua. Ko te qmRGA i whakaatu i nga mahi tohu GA teitei ake i roto i nga ruma IPR internode progenitor. Na roto i te whakakotahi i nga whakaahua ine me nga ira, i whakaatuhia e matou ko nga tauira tohu tohu GA kei te whakakikorua i nga rererangi wehenga porowhita / whakawhiti i roto i te SAM epidermis, e hanga ana i te whakahaere wehenga pūtau e hiahiatia ana mo te whanaketanga o roto. He maha nga kaiwhakariterite o te whakatakotoranga rererangi wehenga pūtau kua kitea i te wa whanaketanga52,53. Ko ta maatau mahi he tauira maamaa mo te whakahaerenga o te mahi tohu tohu GA i tenei tawhā pūkoro. Ka taea e DELLA te pahekoheko me te whakahiato i mua i nga matatini pūmua41, no reira ka taea e te tohu GA te whakarite te whakatakotoranga rererangi wehenga pūtau ma te awe tika i te tuunga microtubule cortical40,41,54,55. I whakaatu ohorere matou i roto i te SAM, ko te hononga o nga mahi tohu tohu GA teitei ake ehara i te elongation pūtau, wehenga ranei, engari ko te anisotropy tupu anake, e rite ana ki te paanga tika o GA ki te ahunga o te wehenga pūtau i roto i te IPR. Heoi, e kore e taea e matou te whakakore ko tenei paanga ka taea hoki te arataki, hei tauira i takawaenga e te whakangawari o te pakitara o te pakitara a GA56. Ko nga huringa i roto i nga ahuatanga o te pakitara o te pakitara ka whakaawe i te ahotea miihini57,58, ka taea hoki te whakaawe i te takotoranga o te rererangi wehenga pūtau ma te pa ki te takotoranga o nga microtubules cortical39,46,59. Ko nga paanga whakakotahitanga o te ahotea miihini a GA me te whakaritenga tika o te whakatakotoranga microtubule e GA ka uru pea ki te whakaputa i tetahi tauira motuhake o te wahanga wehenga pūtau i roto i te IPR hei tautuhi i nga internodes, me etahi atu rangahau hei whakamatautau i tenei whakaaro. Waihoki, ko nga rangahau o mua i whakaatu i te hiranga o te DELLA-interacting proteins TCP14 me te 15 i roto i te mana o te hanganga o roto60,61 a ka taea e enei mea te takawaenga i te mahi a GA tahi me BREVIPEDICELLUS (BP) me PENNYWISE (PNY), e whakahaere ana i te whakawhanaketanga o roto me te whakaatu ki te awe i te tohu tohu GA2,62. I te mea ko nga DELLA e mahi tahi ana me te brassinosteroid, ethylene, jasmonic acid, me te waikawa abscisic (ABA) nga tohu tohu ara63,64 me enei homoni ka taea te awe i te microtubule orientation65, ko nga paanga o te GA i runga i te wahanga wehenga pūtau ka taea hoki te takawaenga e etahi atu homoni.
Ko nga rangahau cytological tuatahi i whakaatu ko nga rohe o roto me waho o te Arabidopsis SAM e hiahiatia ana mo te whakawhanaketanga o roto2,42. Ko te mea e kaha ana a GA ki te whakahaere i te wehenga pūtau i roto i nga kopa o roto12 e tautoko ana i te mahi takirua a GA ki te whakahaere i te rahi meristem me te rahi o roto i te SAM. Ko te tauira o te whakawehenga o nga pūtau aronga he mea whakarite i roto i te kiko SAM o roto, a he mea nui tenei ture mo te tipu o te kakau52. He rawe ki te tirotiro mena kei te whai waahi ano a GA ki te whakatikatika i te rererangi wehenga pūtau i roto i te whakahaeretanga SAM o roto, na reira ka tukutahi i te tohu me te whakawhanaketanga o nga internodes i roto i te SAM.
I tipuhia nga tipu i roto i te vitro i roto i te oneone, i te 1x Murashige-Skoog (MS) medium (Duchefa) ranei i tapirihia ki te 1% sucrose me te 1% agar (Sigma) i raro i nga tikanga paerewa (16 h marama, 22 °C), engari mo nga whakamatautau tipu hypocotyl me te pakiaka i tipu ai nga tipu ki runga i nga papa poutū i raro i te marama tonu me te 22 °C. Mo nga whakamatautau pākawa, i tipuhia nga tipu ki runga i te reo MS kua whakarereketia (bioWORLD tipu reo) kua taapirihia ki te pakawa tika (0, 10 mM KNO3 ranei), 0.5 mM NH4-succinate, 1% sucrose me te 1% A-agar (Sigma) i raro i nga ra roa.
Ko te GID1a cDNA i whakauruhia ki roto i te pDONR221 i honoa ki te pDONR P4-P1R-pUBQ10 me te pDONR P2R-P3-mCherry ki pB7m34GW hei whakaputa pUBQ10::GID1a-mCherry. Ko te IDD2 DNA i whakauruhia ki roto i te pDONR221 i honoa ano ki te pB7RWG266 hei whakaputa p35S:IDD2-RFP. Hei whakaputa i te pGID1b::2xmTQ2-GID1b, he wahanga 3.9 kb whakarunga o te rohe whakawaehere GID1b me tetahi kongakonga 4.7 kb kei roto te GID1b cDNA (1.3 kb) me te terminator (3.4 kb) i whakanuia tuatahitia ma te whakamahi i nga mea tuatahi i roto i te PNR1 Ripanga 3 me te PNR1. Fisher Scientific) me te pDONR P2R-P3 (Thermo Fisher Scientific), katahi ka whakakotahi ano me te pDONR221 2xmTQ268 ki roto i te pGreen 012567 te vector whainga ma te whakamahi i te kati o Gateway. Hei whakaputa pCUC2::LSSmOrange, ko te raupapa kaiwhakatairanga CUC2 (3229 bp whakarunga o te ATG) ka whai i te raupapa whakawaehere o te nui Stokes-shifted mOrange (LSSmOrange)69 me te tohu whakauru karihi N7 me te NOS transcriptional terminator i whakaemihia ki te pGreen targeting vector kanamycin pGreen. (Invitrogen). I whakaurua te vector rua tipu ki roto Agrobacterium tumefaciens strain GV3101 ka whakaurua ki roto ki nga rau Nicotiana benthamiana na te tikanga whakauru Agrobacterium me te araidopsis thaliana Col-0 ma te tikanga ruku putiputi. pUBQ10::qmRGA pUBQ10::GID1a-mCherry me pCLV3::mCherry-NLS qmRGA i wehea mai i nga uri F3 me F1 o ia whiti.
I mahia te RNA in situ hybridization i runga i te tata ki te 1 cm te roa o nga tohutohu wana72, i kohia ka whakatika tonu ki te otinga FAA (3.7% formaldehyde, 5% waikawa acetic, 50% ewaro) i mua i te whakamatao ki te 4 °C. I muri i nga maimoatanga korehau 2 × 15 meneti, ka whakarereketia te whakatikanga, ka whakakororia nga tauira mo te po. Ko nga GID1a, GID1b, GID1c, GAI, RGL1, RGL2, me RGL3 cDNA me nga rangahau antisense ki o raatau 3′-UTR i whakahiatohia ma te whakamahi i nga tohu tuatahi e whakaatuhia ana i roto i te Ripanga Tāpiri 3 i whakaahuahia e Rosier et al.73. Ko nga rangahau kua tapaina ki te Digoxigenin i tohuhia ki te mate ma te whakamahi i nga antibody digoxigenin (3000-fold dilution; Roche, nama putumōhio: 11 093 274 910), ka pania nga waahanga ki te 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate (BCIP, 250-foldlue tetrafoldN0,250/nitrobluetrafold)2. dilution) otinga.
Wā tuku: Feb-10-2025