Ko te raau taero N,N-diethyl-m-toluamide (DEET) kua puta te korero ki te aukati i te AChE (acetylcholinesterase) me te whai huatanga mate pukupuku na te nui o te vascularization. I roto i tenei pepa, e whakaatu ana matou ko te DEET e whakaihiihi ana i nga pūtau endothelial e whakatairanga ana i te angiogenesis, na reira ka piki ake te tipu o te puku. Ka whakahohehia e DEET nga tukanga pūkoro e arai ana ki te angiogenesis, tae atu ki te whakatipuranga, te heke, me te piri. E pa ana tenei ki te nui ake o te whakaputa NO me te whakaaturanga VEGF i roto i nga pūtau endothelial. Ko te wahangu o te M3, te whakamahi ranei i nga aukati M3 rongoora i whakakore i enei paanga katoa, e kii ana ko te angiogenesis na te DEET he M3-tairongo. Ko nga whakamatautau e pa ana ki te tohu konupūmā i roto i nga pūtau endothelial me te HEK e whakaatu ana i nga kaiwhakawhiwhi M3, tae atu ki nga rangahau here me te taatai, e tohu ana ko te DEET te mahi hei modulator allosteric o nga kaiwhakawhiwhi M3. I tua atu, ka aukati te DEET i te AChE, na reira ka piki ake te koiora o te acetylcholine me tona here ki nga kaiwhakawhiwhi M3, me te whakarei ake i nga paanga proangiogenic na roto i te ture allosteric.
Ko nga EC tuatahi i wehea mai i te aorta o nga kiore Swiss. Ko te tikanga tangohanga i urutau mai i te kawa Kobayashi 26 . Ko nga Murine EC i whakatipuhia i roto i te reo EBM-2 kua taapirihia ki te 5% te wera-kore FBS tae noa ki te wha o nga waahanga.
Ko te painga o nga kohinga e rua o DEET i runga i te tipu o HUVEC, U87MG, BF16F10 ranei i tātarihia ma te whakamahi i te CyQUANT Cell Proliferation Assay Kit (Molecular Probes, C7026). He poto, 5.103 nga pūtau mo ia puna i ruia ki roto i te pereti 96-puna, ka waiho kia piri mo te po, katahi ka rongoa ki te DEET mo te 24 haora. Whai muri i te tangohanga o te reo tipu, taapirihia he waikano here ki ia puna o te pereti moroiti, ka whakakororia i nga ruma ki te 37 °C mo te 30 meneti. I whakatauhia nga taumata rewharewha ma te whakamahi i te Mithras LB940 multimode microplate reader (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Germany) me te 485 nm nga whiriwhiringa whakaongaonga me nga whiriwhiringa 530 nm.
I ruia te HUVEC ki nga pereti 96-puna i te kiato 104 nga pūtau mo ia puna. I tukinotia nga pūtau ki te DEET mo te 24 haora. I aromatawaihia te kaha o te pūtau ma te whakamahi i te whakamatautau MTT colorimetric (Sigma-Aldrich, M5655). I whiwhi nga uara kiato oro ki runga i te kaipanui microplate multimode (Mithras LB940) i te roangaru 570 nm.
I akohia nga paanga o te DEET ma te whakamahi i nga whakamatautau angiogenesis in vitro. Ko te maimoatanga me te 10-8 M ranei 10-5 M DEET i whakanui ake i te hanganga o te roa o te capillary i roto i nga HUVEC (Fig. 1a, b, tutaki ma). Ka whakatauritea ki te roopu whakahaere, ko te maimoatanga me nga kohinga DEET mai i te 10-14 ki te 10-5 M i whakaatu ko te roa o te capillary i tae ki te papaahi i te 10-8 M DEET (Taupiri Fig. S2). Karekau he rereketanga nui i kitea i roto i te huanga in vitro proangiogenic o HUVEC i rongoa ki te DEET i te awhe kukū o te 10-8 M me te 10-5 M.
Hei whakatau i te paanga o te DEET ki te neovascularization, i mahia e matou i roto i nga rangahau neovascularization vivo. I muri i nga ra 14, ko nga kiore i werohia ki nga pūtau endothelial i mua i te 10-8 M ranei 10-5 M DEET i whakaatu i te pikinga nui o te ihirangi hemoglobin (Fig. 1c, tutaki ma).
I tua atu, i akohia te neovascularization a DEET i roto i nga kiore xenograft-bearing U87MG i werohia i ia ra (ip) me te DEET i te horopeta e mohiotia ana ki te whakauru i te plasma concentrations o 10-5 M, he mea noa i roto i nga tangata kua kitea. i roto i te 23. Ko nga pukupuku ka kitea (arā, ko nga pukupuku>100 mm3) i kitea i te 14 nga ra i muri i te werohanga o nga pūtau U87MG ki nga kiore. I te ra 28, i tino whakanuihia te tipu o te pukupuku i roto i nga kiore kua tukinotia e te DEET i whakaritea ki nga kiore whakahaere (Fig. 1d, tapawha). I tua atu, ko te whakakikoruatanga o te CD31 o nga pukupuku e whakaatu ana i tino whakanuia e DEET te rohe kapi engari ehara i te kiato o nga waka moroiti. (Whakaahua 1e–g).
Hei whakatau i te mahi a nga kaiwhakawhiwhi muscarinic i roto i te whakatipuranga a DETA, 10-8 M ranei 10-5 M DETA i te aroaro o te pFHHSiD (10-7 M, he kaiwhakawhanake M3 whiriwhiringa antagonist) i whakamahia. Te maimoatanga o HUVEC. Ko te pFHHSiD i tino aukati i nga ahuatanga whakatipu o DETA i nga kohinga katoa (Ripanga 1).
I raro i enei tikanga, i tirotirohia ano e matou mehemea ka whakanuia e DEET te roa o te kapi i roto i nga pūtau HUVEC. Waihoki, i tino aukati te pFHHSiD i te roa o te capillary a DEET (Whakaahua 1a, b, tutaki hina). I tua atu, i mahia nga whakamatautau rite ki a M3 siRNA. Ahakoa kaore i whai hua te mana siRNA ki te whakatairanga i te hanganga o te kapi, ko te whakamutua o te M3 muscarinic receptor ka whakakore i te kaha o te DEET ki te whakanui ake i te roa o te capillary (Fig. 1a, b, pango pango).
I tua atu, ko te 10-8 M ranei 10-5 M DEET-induced vascularization in vitro me te neovascularization in vivo i tino aukatihia e te pFHHSiD (Fig. 1c, d, porowhita). Ko enei hua e tohu ana ko te DEET e whakatairanga ana i te angiogenesis na roto i te huarahi e pa ana ki nga kaiwhaiwhai M3 kaiwhakawhanake, M3 siRNA ranei.
Ko AChE te whainga irapoi o DEET. Ko nga raau taero penei i te donepezil, e mahi ana hei aukati AChE, ka taea te whakaihiihi i te EC angiogenesis in vitro me nga tauira ischemia hindlimb kiore14. I whakamatauria e matou te awenga o nga kuhanga e rua o te DEET ki runga i te mahi enzyme AChE i HUVEC. Ko te iti (10-8 M) me te teitei (10-5 M) o te DEET i whakaheke i te mahi AChE endothelial i whakaritea ki nga tikanga whakahaere (Fig. 2).
Ko nga kohinga e rua o DEET (10-8 M me 10-5 M) i whakaitihia te mahi acetylcholinesterase i runga i te HUVEC. I whakamahia te BW284c51 (10-5 M) hei mana whakahaere mo nga aukati acetylcholinesterase. Ko nga hua ka whakaatuhia hei paheketanga o te ngohe AChE i runga i te HUVEC i tukinotia ki nga kuhanga e rua o te DEET ki te whakataurite ki nga pūtau mahi waka. Ko nga uara e whakaatuhia ana ko te toharite ± SEM o nga whakamatautau motuhake e ono. *p <0.05 ka whakaritea ki te mana whakahaere (Kruskal-Wallis me Dunn te whakamatautau whakataurite maha).
Ko te waikura nitric (NO) e uru ana ki te tukanga angiogenic 33, no reira, KORE te hanga i roto i nga HUVEC whakaihiihi i te DEET i akohia. Ko te whakaputanga NO endothelial NO te maimoatanga a DEET kua piki ake i whakaritea ki nga pūtau whakahaere, engari i tae ki te hiranga anake i te horopeta o te 10-8 M (Fig. 3c). Hei whakatau i nga huringa ngota e whakahaere ana i te whakangao KORE na te DEET, i tātarihia te whakaaturanga eNOS me te whakahohenga ma te whakakore i te Hauauru. Ahakoa kaore te maimoatanga DEET i whakarereke i te whakahuatanga o te eNOS, i tino piki ake te phosphorylation eNOS i tana waahi whakahohe (Ser-1177) i te whakaheke i tana waahi aukati (Thr-495) i whakaritea ki nga ruma kaore i tukuna i roto i te phosphorylation eNOS (Fig. 3d). I tua atu, ko te ōwehenga o te eNOS phosphorylated i te waahi whakahohe me te waahi aukati i tatauhia i muri i te whakarite i te nui o te eNOS phosphorylated ki te tapeke o te enzyme. I tino piki ake tenei tauwehenga i roto i nga HUVEC i tukinotia ki ia kukū o te DEET i whakaritea ki nga pūtau kaore i rongoatia (Fig. 3d).
Ka mutu, ko te whakapuakitanga o te VEGF, tetahi o nga tino take proangiogenic, i tātarihia e te Western blotting. I tino whakanuia e DEET te whakaaturanga VEGF, engari i aukatia katoatia e pFHHSiD tenei korero.
I te mea he tairongo nga paanga o te DEET ki te aukati rongoa me te whakahekenga o nga kaiwhakawhiwhi M3, i whakamatauria e matou te whakapae ka taea e DEET te whakanui i te tohu konupūmā. He mea whakamiharo, kaore i taea e DEET te whakanui ake i te konupūmā cytoplasmic i HUVEC (kaore i whakaatuhia nga raraunga) me te HEK / M3 (Fig. 4a, b) mo nga whakawhitinga e rua i whakamahia.
Wā tuku: Tihema-30-2024